[发明专利]检测CYP2D6*10基因突变的检测体系及其试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测CYP2D6*10基因突变的检测体系及其试剂盒，包括数字PCR预混液和引物探针混合液；引物探针混合液包括用于检测CYP2D6基因CYP2D6*10位点的上游引物、下游引物和肽核酸探针；上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，肽核酸探针的核苷酸序列与CYP2D6*10突变型基因位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述肽核酸探针的5’端连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团。本发明的检测CYP2D6*10基因突变的检测体系及其试剂盒灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行PCR定量检测。

技术领域

本发明涉及一种检测CYP2D6*10基因突变的检测产品，属于生物技术领域。

背景技术

异喹胍4’-羟化酶(CYP2D6)是细胞色素P450超家族(cytochrome P450s,CYP)的第二亚家族中的重要成员。CYP2D6*10基因型多态性与接受他莫昔芬(tamoxifen,TAM)治疗乳腺癌患者生存率密切相关。人群中CYP2D6的活性呈现强代谢者(EM)、中间代谢者(IM)、弱代谢者(PM)和超强代谢者(UM)四态分布的现象。目前已发现CYP2D6有100多种突变基因，它的突变类型决定酶代谢活性。CYP2D6基因多态性决定了药物代谢强度的差异，并影响临床用药品种和剂量的选择。CYP2D6除参与代谢一些内源性物质和某些环境中毒性化合物外，还参与20-30％的临床常用药物的代谢，包括β受体阻滞剂、多种抗心律失常药、抗高血压药、抗抑郁、抗精神病药、镇痛药、镇咳药等。中国人群中CYP2D6最常见的导致酶活性降低的等位基因为CYP2D6*10，与野生型CYP2D6*1相比，其外显子1上发生100C>T的点突变，引起该酶第34位脯氨酸(P)被丝氨酸(S)所替代所致，导致IM表型。目前主要采用一代测序、FLP、等位基因特异的寡核苷酸杂交、等位基因特异的PCR和基因芯片等技术，但是操作过程繁琐，需要更换反应管而易发生污染，多需要电泳和多步后处理，影响检测结果的准确性。或仪器设备昂贵，难以大规模推广应用。

外周血细胞游离DNA是来自正常细胞和肿瘤细胞死亡后释放的核酸片段总称。由于其再体内的半衰期较短且细胞释放的核酸会进入外周血，因此cfDNA较之于组织标本更能实时全面地反映患者体内的肿瘤情况。使用灵敏度较低的常规方法检测只能发现小部分患者在接受特定治疗前的肿瘤变异，采用高灵敏度法(如dPCR)检测则可以发现较高比例的携带突变型患者。数字PCR由于灵敏度等方面的优势，通过单分子扩增把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来，可用于疾病或病毒的早期诊断或疗效监测。与常规的ARMs方法相比，数字PCR在检测血浆cfDNA时灵敏度明显优于ARMs法。

PNA(peptide nucleic acid)中文名称肽核酸，是一种全新的人工合成DNA类似物，它与DNA分子的差异在于戊糖磷酸二酯键骨架被中性肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代，其他结构与DNA一致。基于PNA的数字PCR技术主要依赖PNA探针的两个重要特性：第一，PNA只能与完全配对的互补DNA链杂交，只要有单一碱基发生错配，PNA就不能与互补的DNA链结合；第二，PNA寡聚体不能被DNA聚合酶识别，从而不会成为PCR扩增的引物。相反，它作为特定序列选择工具，可以阻止想应的PCR扩增。一旦模板中的目的基因发生突变并因此出现错配，DNA/PNA双链结合松动，DNA寡聚体模板链就可以正常延伸，作为PCR引物，使发生突变的样本在数字PCR中得到阳性扩增产物，而野生型基因则不会扩增。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种包含由强螯合基团修饰的肽核酸探针，灵敏度和特异性高，最终模板DNA需求量少，可以快速便捷地进行精准定量PCR检测的CYP2D6*10基因突变检测检测体系及其试剂盒。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种检测CYP2D6*10基因突变的检测体系，包括数字PCR预混液和引物探针混合液；