[发明专利]一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体及其构建方法和应用，将带有点突变的琥珀酸脱氢酶铁硫亚基的DNA片段连入质粒载体，记为pTSdi。本发明的转化载体可以用于转化杏鲍菇，使其获得对真菌杀菌剂萎锈灵的抗性；另外由于在构建的转化载体中留有插入外源基因片段的酶切位点，可以方便地插入感兴趣的外源基因，转化到杏鲍菇中进行遗传学研究，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体及其构建方法和应用。

背景技术

近年来我国杏鲍菇的工厂化栽培发展迅速，成为继金针菇之后发展最快的设施栽培食用菌品种。利用现代分子生物学技术改良杏鲍菇品种，获得产量高、生长周期短、抗杂菌能力强的菌株，是杏鲍菇遗传研究的重要课题。构建杏鲍菇的遗传转化系统首先要建立分子生物学工具，如抗性筛选标记和驱动外源基因表达的启动子等。

通常对基因进行点突变需要购买商业试剂盒，价格不菲而且操作繁琐。因此，引入突变位点的DNA序列可以为构建萎锈灵抗性遗传转化载体提供基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体及其构建方法和应用，解决了实现对基因进行点突变成本过高的问题。

本发明提供了一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体，将带有点突变的琥珀酸脱氢酶铁硫亚基的DNA片段连入质粒载体，记为pTSdi。

本发明还提供了一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体的构建方法，包括：

(1)提取杏鲍菇单核菌丝全基因组DNA，检测DNA质量和浓度；

(2)在需要进行点突变的位置引入一对互补引物sdi2F和sdi1R；以提取的基因组DNA为模板，利用正向引物sdi1F和反向引物sdi1R扩增第一部分的DNA片段；以提取的基因组DNA为模板，利用正向引物sdi2F和反向引物sdi2R扩增第二部分的DNA片段；利用限制性内切酶MfeI消化两部分DNA片段，再采用T4连接酶将消化后的两部分DNA片段连接成完整DNA片段；

(3)将完整DNA片段通过TA载体连接，导入pGEM-Teasy质粒载体中，获得转化载体pTSdi。

所述步骤(2)中的sdi1F的序列为：TCACGTCCTCAATAAGCGCTC；

sdi1R的序列为：ACAATTGAAAATGGTGAGGC；

sdi2F的序列为：GCCTCACCATTTTCAATTGT；

sdi2R的序列为：AGCACCGCAAGTGAGACCAA。

上述引物为PCR扩增琥珀酸脱氢酶复合物的铁硫蛋白亚基的引物。

本发明还提供了一种杏鲍菇萎锈灵抗性筛选转化载体的应用，应用于携带外源基因进行杏鲍菇的遗传转化。

有益效果

本发明的转化载体可以用于转化杏鲍菇，使其获得对真菌杀菌剂萎锈灵的抗性；另外由于在构建的转化载体中留有插入外源基因片段的酶切位点，可以方便地插入感兴趣的外源基因，转化到杏鲍菇中进行遗传学研究，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为用于构建转化载体pTSdi的引物位置；

图2为本发明转化载体pTSdi的示意图；

图3为利用PCR结合酶切鉴定杏鲍菇转化子的示意图。

具体实施方式