[发明专利]一种T790M基因突变的数字PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种T790M基因突变的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增引物和检测探针，其中，所述扩增引物包括上、下游引物，所述上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：25～26所示，所述检测探针包括突变型探针和野生型探针，所述突变型探针和野生型探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：65～66所示；

所述突变型探针和所述野生型探针为Taqman-MGB探针；所述突变型探针的5’端标记FAM，3’端标记MGB，所述野生型探针的5’端标记VIC，3’端标记MGB；

所述上游引物、下游引物、突变型探针和野生型探针的摩尔比为9:9:2.5:2.5；

所述上游引物的浓度为900nM、所述下游引物的浓度为900nM，所述突变型探针的浓度为250nM，所述野生型探针的浓度为250nM。

2.根据权利要求1所述的数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括其他辅助检测试剂，所述其他辅助检测试剂包括：Taq酶、dNTPs、缓冲液、水、阴性质控品和阳性质控品；所述Taq酶、dNTPs和缓冲液混合为单试剂。

3.根据权利要求2所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液中包括Tris·Cl、K⁺和Mg²⁺；所述K⁺由KCl提供，所述Mg²⁺由MgSO₄和MgCl₂提供。

4.根据权利要求3所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为不含T790M基因突变的人基因组DNA，所述阳性质控品为含T790M基因突变的人基因组DNA；

所述不含T790M基因突变的人基因组DNA为细胞系NCI-H222的基因组DNA，所述含T790M基因突变的人基因组DNA为细胞系NCI-H1975的基因组DNA；

所述阳性质控品和/或阴性质控品中人基因组DNA的浓度为1ng/μl。

5.一种T790M基因突变的检测方法，所述方法为非疾病诊断目的，其特征在于，所述方法包括：

(1)使用权利要求1～4任一项所述试剂盒对样本进行数字PCR；(2)根据所述数字PCR的扩增结果，判读所述样本的T790M基因突变检测结果。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述数字PCR的反应体系包括：

所述数字PCR的反应体系包括：900nM上游引物、900nM下游引物、250nM突变型探针、250nM野生型探针和1ng/μl DNA模板。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述数字PCR的扩增程序包括：92～97℃预变性5～15分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，92～97℃变性10～60s，50～65℃退火并延伸30～60s，所述扩增阶段循环35～55次。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述数字PCR的扩增程序包括：95℃预变性10分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，94℃变性30s，55.6℃退火并延伸60s，所述扩增阶段循环40次。

9.根据权利要求5-8任一项所述的检测方法，其特征在于，所述样本为细胞、体液、组织或排泄物，所述体液包括血清、血浆或组织液。