[发明专利]一种T790M基因突变的数字PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及一种T790M基因突变的数字PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明所述试剂盒包括扩增引物和检测探针，其中，所述扩增引物包括上、下游引物，所述上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：25～26所示，所述检测探针包括突变型探针和野生型探针，所述突变型探针和野生型探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：65～66所示。本发明所述试剂盒和检测方法具有精确度和灵敏度高，检测时间短，可实现低丰度、低突变率样品的定性和定量检测的优点，有助于实现T790M基因突变的早期、无创、定量检测。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体而言，涉及一种T790M基因突变的数字PCR检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

T790M基因突变是在肿瘤患者中发现的一种基因突变类型，具体是指表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)第20号外显子第790氨基酸位点由苏氨酸(T)突变为甲硫氨酸(G)，基因水平表现为ACG突变为ATG。由于甲硫氨酸比苏氨酸空间占位大，因此形成空间位阻，改变EGFR激酶区ATP的亲和性，导致EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)类小分子药物不能有效阻断EGFR活化信号，从而失去对肿瘤细胞杀伤作用。目前研究结果表明，T790M基因突变与肿瘤患者的耐药性、疗效预测、预后相关，而在诸如血液的体液样本中检测T790M基因突变具有显著的优势，适用于肿瘤标本不可评估(较难通过手术或穿刺获得肿瘤组织)的患者，并在一定程度上有效克服肿瘤异质性，可实现无创实时动态检测。因此，检测T790M基因突变，尤其是检测体液样本诸如血液中的T790M基因突变，无论是在临床还是在科研上均具有重要意义。

目前，基因突变的检测方法包括直接测序法、变性高效液相色谱法、高分辨率溶解曲线和探针扩增阻滞突变法。其中，直接测序法的检测灵敏度约20％，只能对组织样本进行检测，并且检测步骤多，周期相对较长；变性高效液相色谱法检测灵敏度约5％左右，检测过程需要多次开盖操作，有一定的污染风险，且最终结果还需要测序才能验证；基于荧光定量PCR平台的高分辨率溶解曲线法检测灵敏度也只有5％左右，无法检测到血浆游离DNA中含量稀少的突变；基于荧光定量PCR平台的另一个突变检测方法探针扩增阻滞突变法检测灵敏度约为0.1-1％,现在已有CFDA批准的血浆游离DNA突变检测试剂盒，但是该方法只能做定性检测，无法定量，无法获取突变比例和拷贝数。

由此可见，目前对于低丰度目标序列的检测，上述方法都可能会受到背景DNA的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精细定量的要求。T790M的检测作为一种对于低丰度目标序列的检测，现有检测方法均不利于T790M基因突变的早期、无创、定量检测。而微滴式数字PCR系统通过液滴化处理，能够使得稀有的核酸序列从大量的背景DNA中分离出来，从而提高了检测的灵敏度与精确性。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种检测T790M基因突变的数字PCR检测试剂盒，所述试剂盒具有精确度和灵敏度高，检测时间短，可实现低丰度、低突变率样品的定性和定量检测的优点，有助于实现T790M基因突变的早期、无创、定量检测。

本发明的第二目的在于提供一种T790M基因突变的检测方法，所述方法具有检测的精确度和灵敏度高，时间短，可实现低丰度、低突变率样品的定性和定量检测的优点，有助于实现T790M基因突变的早期、无创、定量检测的优点。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种T790M基因突变的数字PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括扩增引物和检测探针，其中，所述扩增引物包括上、下游引物，所述上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ IDNO：25～26所示，所述检测探针包括突变型探针和野生型探针，所述突变型探针和野生型探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：65～66所示。