[发明专利]环介导等温扩增检测肺炎支原体的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种环介导等温扩增检测肺炎支原体的试剂盒，所述试剂盒包括引物组，所述引物组由SEQ ID NO:1所示的上游外部引物F3、SEQ ID NO:2所示的下游外部引物B3、SEQ ID NO:3所示的上游内部引物FIP和SEQ ID NO:4所示的下游内部引物BIP组成。本发明的试剂盒具有特异性强、灵敏度高等特点，检测肺炎支原体方便快捷、价格低廉，适用于基层医疗单位推广使用。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种环介导等温扩增检测肺炎支原体的试剂盒及方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，MP)是一种介于病毒和细菌之间的无细胞壁型微生物，也是引起儿童社区获得性肺炎的重要病原体，四季均有病例出现，但以夏秋季发病为主。MP感染多见于学龄期儿童，在因呼吸道感染住院患儿中约占19.1-26％。除了引起肺部感染外，MP还可引起多种肺外并发症，从而引起多器官功能的损害。

MP导致的肺炎早期临床表现、影像学检查等常常缺乏特异性，难以通过临床症状和体征来进行诊断，且MP对β内酰胺酶类抗生素无效，需要使用大环内酯类抗生素进行治疗，MP感染还可能导致一些严重的临床综合征，因此准确而快速诊断MP的感染至关重要。

MP的实验室检测方法包括MP培养、血清学检测和核酸扩增技术(NAAT)。培养法是诊断MP感染的可靠标准，MP的临床分离株对监测其流行病学趋势也至关重要，但MP生长缓慢，通常需要2周以上才能看到结果，且培养阳性率低，因此不适用于临床常规检测。血清学检测是目前临床应用最广泛MP检测方法，包括明胶颗粒凝集实验、酶联免疫吸附试验、血清冷凝集实验及补体结合实验等。

人体感染MP会产生特异性IgM、IgA及IgG类抗体，恢复期和急性期MP抗体滴度呈4倍或4倍以上增高或减低时，可确诊为MP感染，但临床上较难采集双份血清进行检测，单份血清结果往往不能真实地反映患儿感染情况。虽然血清IgM类抗体出现早于IgG抗体，但免疫力低下患儿或2岁以下的婴幼儿因免疫系统发育不全，感染MP后抗体不产生从而导致假阴性。

随着分子生物学的快速发展，NAAT逐渐经成为早期快速诊断MP感染的重要方法，其具有灵敏度高、特异性强等优点，且不受感染时间限制，也不受患儿免疫功能的影响，对于MP感染的早期诊断有重要意义。NAAT主要包括PCR法、实时荧光PCR法、多重PCR及环介导等温扩增(LAMP)等，PCR法需要昂贵的PCR循环仪器，且对操作人员技术水平要求较高，难以在基层医疗单位广泛应用。2000年报道了一种新的核酸扩增方法—环介导等温扩增(LAMP)，其原理是使用具有链置换活性的DNA聚合酶和一组专门设计的引物在恒温条件下快速高效地扩增靶DNA。与传统的检测方法相比，LAMP的4个引物是根据靶序列的6个不同区域设计的，具有高度特异性，一旦有引物不匹配将导致反应不会发生。另外，LAMP检测比PCR灵敏度高10-100倍，可以检测10拷贝甚至更少的模板。更重要的是，LAMP反应成本低廉，操作简单，仅需要水浴锅等简单设备就能完成反应。LAMP扩增结果可以通过使用染料直接查看，从而缩短检测时间。

目前市场上已有使用LAMP方法检测MP的试剂盒，但其需要反应60min，且需要在检测完成后打开反应管加入荧光染料SYBR Green观察颜色变化，由于LAMP灵敏性极高，开盖后难以避免出现气溶胶污染，还需要在紫外灯设备，因此需要一种更快速的全程闭管的LAMP检测MP的方法，直接肉眼观察颜色变化，从而减少污染并满足基层医疗单位的检测需求。

发明内容

本发明针对现有技术中肺炎支原体检测速度慢、成本高以及操作复杂的技术问题，目的在于提供一种环介导等温扩增检测肺炎支原体的试剂盒，以满足基层医疗单位的检测需求。