[发明专利]人源化单克隆抗体、其制备方法及其用途

说明书

本发明公开一种抗人CD20人源化单克隆抗体、编码该抗体的核酸分子、包含该核酸分子的重组载体、包含所述重组载体的重组细胞以及所述抗人CD20人源化单克隆抗体的制备方法及其医药用途。其中，编码所述抗体的核酸分子包含如SEQ ID NO:1所示的编码轻链的核苷酸序列和如SEQ ID NO:2所示的编码重链的核苷酸序列；并分别在所述两个序列上设计信号肽和终止密码子。本发明由于对密码子进行优化，转基因后的CHO细胞表达抗人CD20人源化抗体的表达量高；且本发明提供的发酵方法，特别是在添加补料批培养基后，延长细胞生长时间，提高表达水平，降低生产成本，获得高纯度的目的蛋白。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种抗CD20人源化单克隆抗体SH006-2、编码该抗体的核酸分子、包含该核酸分子的重组载体、包含所述重组载体的重组细胞以及所述抗CD20人源化单克隆抗体SH006-2的制备方法及其医药用途。

背景技术

CD20抗原是前B细胞和成熟的B淋巴细胞上的疏水性跨膜蛋白，其对B淋巴细胞的增殖和分化具有非常重要的调节作用。CD20在早期前B细胞发育过程中表达，并且持续表达至浆细胞分化时。研究发现，超过90％的非霍奇金淋巴瘤患者、慢性淋巴瘤患者及大B细胞淋巴瘤患者B细胞表面高表达CD20抗原。抗CD20单克隆抗体可以与肿瘤表面的CD20分子结合，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(complement-dependent cytotoxicity，CDC)杀死肿瘤细胞。

自1997年第一个抗CD20治疗性单抗利妥昔单抗(rituximab，美罗华)被FDA批准上市至今，利妥昔单抗一直位列全球畅销药物前列，同时也推动了该类药物的迅速发展。根据抗体不同的结构、人源化程度以及Fc段修饰等大致经历了3代研发：第一代抗体为鼠源抗体或嵌合型抗体(-ximab，以利妥昔单抗最具代表性)；第二代抗体为人源化抗体(-zumab)或全人源抗体(-mumab，以奥法木单抗(ofatumumab，)为代表)，其相较于第一代抗体免疫原性大大降低；第三代抗体则是在第一代和第二代的基础上通过糖基化等工程对抗体Fc段进行改造修饰从而增加抗体对FcγIIIa结合亲和力而增强效应功能，最终提高治疗活性(以奥奴珠单抗(obinutuzumab，GA101)为代表)。

现有的利妥昔单抗属于人鼠嵌合抗体，分子中含有较多的鼠源氨基酸序列，可能存在一定的输液反应和免疫原性而导致安全性方面的隐患。目前的临床实践已表明，利妥昔单抗的常见不良反应之一即为输液反应性。而且已有大量临床数据表明，对于低度恶性淋巴瘤，的单药疗效约为50％，另外50％左右病人无效，60％初治有效病人再次治疗无效；对于恶性度较高的弥漫大B细胞淋巴瘤、CD20表达低下的慢性淋巴细胞性白血病患者，即使与CHOP方案(环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松)联合应用，仍然有半数或以上患者治疗无效或复发。

此外，目前世界上抗体药物的产能远低于需求量。抗体的产量除了受制于培养规模、生产工艺以及纯化工艺等因素外，从很大程度上还依赖于抗体基因的偏好性及其在哺乳动物细胞内的表达水平。

发明内容

为了克服现有技术的不足、获得具有更高表达水平和生物学活性的新抗体，本发明公开了一种通过信号肽及密码子优化和基因敲除技术获得的抗人CD20人源化单克隆抗体SH006-2的核酸分子，继而通过载体构建、细胞转染、细胞株筛选、细胞培养和活性物质生产、纯化等手段获得的岩藻糖完全敲除的重组抗人CD20人源化单克隆抗体SH006-2。本发明具体包括以下几个方面：

本发明的第一方面涉及编码抗人CD20人源化单克隆抗体SH006-2的核酸分子，其特征在于包含编码轻链的核苷酸序列和编码重链的核苷酸序列。

编码轻链的核苷酸序列为：