[发明专利]实时荧光定量PCR检测外源GhCAD6基因在棉花纤维中表达量的方法在审
| 申请号： | 201810706577.2 | 申请日： | 2018-06-20 |
| 公开（公告）号： | CN110616250A | 公开（公告）日： | 2019-12-27 |
| 发明（设计）人： | 胡文冉;苏秀娟;李晓荣;周小云;杨洋;李波;范玲;樊国全;刘建喜;邓晓娟 | 申请（专利权）人： | 新疆农业科学院核技术生物技术研究所(新疆维吾尔自治区生物技术研究中心);新疆农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 830091 新疆维吾尔自*** | 国省代码： | 新疆;65 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 棉花纤维 表达量 外源 基因 实时荧光定量PCR 硼酸 基因表达调控 棉花纤维品质 特异性引物 蛋白酶K法 电泳 发育阶段 繁琐步骤 反应程序 反应条件 内参基因 肉眼判断 实时荧光 荧光信号 自动收集 棉花 常规PCR 反转录 灵敏度 棉纤维 主观性 检测 荧光 扫描 改良 研究 保证 | ||
1.一种实时荧光定量PCR检测外源GhCAD6基因在棉花纤维中表达量的方法，其特征是采用符合荧光PCR反应特点的目标基因及内参基因的特异性上、下游引物，利用实时荧光定量PCR检测目标基因在不同发育阶段棉花纤维中的表达量，其具体步骤为：
a、棉花纤维总RNA提取：采用热硼酸-蛋白酶K法提取不同发育阶段棉花纤维的RNA；
b、cDNA第一链合成：以棉花RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系为20μL；
c、实时荧光PCR：以上述合成的cDNA第一链为模板，利用如下引物作为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值取平均数；
符合荧光PCR反应特点的该目的基因GhCAD6序列特异性上下游引物：
GhCAD6-F：5’-GTTCCTGGGCATGAAGTGGT-3’
GhCAD6-R：5’-TGCAACATCCAACAAGACAACC-3’
以及作为内参基因的棉花GhUBQ7基因特异性上下游引物：
GhUBQ7-F：5’-AGAGGTCGAGTCTTCGGACA-3’
GhUBQ7-R：5’-GCTTGATCTTCTTGGGCTTG-3’
其荧光定量定量PCR的反应体系为：总体积为20μL，内含Select Master Mix(2X)10μL，Forward primer(10μM)0.40μL，Reverse primer(10μM)0.40μL，cDNA 1μL，RNase-free水补足到20μL；
实时荧光定量PCR扩增的反应条件为：UDG Activation AmpliTaq DNA，50℃，2min；Polymerase，UP Activation，95℃，2min；PCR反应40cycles，95℃，15sec，60℃，1min；
d、不同发育阶段棉花纤维中GhCAD6基因的相对表达量计算：实时荧光PCR完成后，根据Ct值计算棉花纤维中GhCAD6基因各时间段下的ΔCt、2-ΔΔCt值，计算方式如下：
ΔCt＝GhCAD6(mean Ct)-GhUBQ7(相同发育阶段mean Ct)
ΔΔCt＝ΔCt(转GhCAD6基因后代样品)-ΔCt(相同发育阶段对照样品)
以2-ΔΔCt数值表示外源GhCAD6基因相对于对照非转基因棉花GhCAD6基因的表达量。
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