[发明专利]实时荧光定量PCR检测外源GhCAD6基因在棉花纤维中表达量的方法

说明书

本发明公开了一种采用实时荧光定量PCR检测外源GhCAD6基因在棉花纤维中的表达量的方法，首先采用热硼酸‑蛋白酶K法提取出棉花纤维的RNA，反转录成cDNA，利用特异性引物和内参基因，在特定的反应条件和反应程序下进行荧光RT‑PCR，检测外源GhCAD6基因在不同发育阶段棉纤维中的表达量，该方法自动收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，提高了实验的灵敏度，保证了结果的可靠性和重复性，免除了常规PCR中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间；本发明中棉花GhCAD6基因实时荧光RT‑PCR检测方法的建立，为研究棉花GhCAD6基因表达调控机理及利用其改良棉花纤维品质的研究奠定了基础。

一、技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种转基因棉花外源基因表达量的分析方法，具体为一种实时荧光定量PCR技术检测外源GhCAD6基因在棉花纤维中表达量的方法。

二、背景技术

新中国成立以来，我国棉花(G.hirsutum)产量和品质都得到了大幅度的提高。但还存在着纤维比强度偏低及纤维品质诸指标搭配不合理等问题，难以满足国内外市场和纺织工业的多种需求(唐淑荣等，2015)。新疆作为我国最大的优质棉生产基地也存在着同样的问题，严重影响着我国棉花在国际上的竞争力(许乃银等，2017)。由于缺乏优异种质和亲本材料，所以在常规育种方面棉花纤维品质改良效果并不明显。目前棉花纤维改良的途径已从常规育种转向常规育种与生物技术育种相结合，其中转基因研究是棉纤维品质改良的一个重要方面。

“十一五”期间国家根据农作物生产的实际需求，启动了转基因重大专项。本项目组范玲研究员主持了转基因生物新品种培育重大专项，在项目开展的过程中，应用自主研究成果，根据肉桂酸脱氢酶(Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase，CAD)是植物细胞壁交联结构形成的重要功能基因，从发育的棉花纤维中克隆出调节细胞壁交联结构形成的相关主效基因GhCAD6(GenBank序列号为：EU281305.1)。CAD是苯丙烷代谢途径上一个重要的基因家族，在形成细胞壁交联结构、细胞壁的延伸停止、次生壁发育起始及次生壁的发育中起重要作用。ChCAD6基因是CAD基因家族中重要的功能基因，该基因的表达量与棉花纤维的次生壁发育同步。项目组将ChCAD6基因利用农杆菌介导法转化棉花受体，获得了多个纤维长度较受体增加1.17-3.21mm(4.22-11.58％)，比强度较受体增加3.2-7.1cN/tex(12.26-27.20％)的转基因株系，且转基因株系经过田间多代种植表现稳定遗传。

外源ChCAD6基因转化棉花受体后获得的转基因后代纤维长度和比强度都得到明显改良，但外源ChCAD6基因在转基因后代植株纤维中尤其是在棉纤维次生壁发育过程中的表达情况还缺乏系统研究。因此，为研究外源GhCAD6改良棉花纤维品质的机理，非常有必要通过研究GhCAD6基因在转基因后代棉花纤维次生壁发育过程中的表达量。

基因表达的定量检测方法很多，主要从蛋白表达水平、mRNA表达水平及外源DNA几个方面入手，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白杂交(Western Blotting)、高效液相色谱(HPLC)、Southern杂交、Northern杂交、生物芯片技术(Biochips)及聚合酶链式反应(PCR)技术、半定量RT-PCR、实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)等等。各个检测方法在检测基因表达量时各有其优缺点，其中实时荧光定量PCR技术具有特异性高、灵敏度高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，保证了结果的可靠性和可重复性，已广泛应用于分子生物学和医学等研究领域。但对于棉花纤维富含酚类化合物、多糖和次生代谢产物，内源RNA酶活性高等特点，适宜的棉花纤维RNA提取方法、合适的引物及内参基因是保证实时荧光定量PCR实施的关键，合适的实时荧光定量PCR反应条件也是实验实施必不可少的内容之一。因此，对于外源GhCAD6基因通过农杆菌介导法转入棉花后，还未见有利用实时荧光定量PCR检测其在不同发育阶段棉花纤维中表达量的报道。

三、发明内容