[发明专利]miRNA-340靶基因结合序列、重组质粒及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学和基因表达调控技术领域，具体涉及一种miRNA‑340靶基因结合序列、重组质粒及其应用，该序列包括：SEQIDNO：1、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7或SEQIDNO：19所示的核苷酸序列。本发明的miRNA‑340靶基因结合序列能够与miRNA‑340结合，其构建的重组质粒能够快速、灵敏、简便地鉴定目标microRNA是否结合IL‑17A 3’UTR调控片段从而起调控作用。

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因表达调控技术领域，具体涉及一种miRNA-340靶基因结合序列、重组质粒及其应用。

背景技术

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类仅有18～25个核苷酸的单链小分子RNA，广泛存在于线虫、果蝇、植物和包括人在内的真核生物中,具有高度的保守性、组织特异性和时序性的非编码RNA分子，不具有开放阅读框(open reading frame)。microRNA的基因位于遗传编码基因的内含子中,也有一部分存在与基因间DNA序列中,形成成熟的microRNA后发挥调控转录后作用。可通过与靶基因的3’端非编码区域(3’UTR)互补配对，在转录后水平对靶基因进行负调控，导致mRNA翻译抑制或者降解，在胚胎发育、细胞分化、凋亡、肿瘤形成等方面发挥着多元化调控作用。

已有研究报道，miRNA-340在肿瘤的发病机制中起到非常重要的作用，并在不同类型的肿瘤研究中，发挥致癌或抑癌的调节作用，通过抑制相关致癌基因包括p-AKT、EZH2、表皮生长因子受体等，或通过靶向相关基因抑制肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌，乳腺癌等发挥抑癌症作用。同时，miRNA-340也可能调节免疫细胞的分化与功能。有研究发现，miRNA-340可通过下调IL-4、Bmi-1等基因靶点来抑制Th2细胞分化，使实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)中的Th2细胞向Th1细胞亚群偏移。进一步了解，miRNA-340抑制Th2通路可促进Th1、Th17细胞的分化，但是否直接靶向IL-17A影响Th17细胞，尚未有研究报道。临床上多发性硬化根据病程特点分为复发-缓解型、继发进展型和原发进展型，有研究发现，从前2种分型患者外周血中分离的记忆性T细胞高度表达miRNA-340，但在原发进展型患者中表达未见明显变化，甚至在活动性硬化斑中有降低现象；同时过表达髓磷脂特异性T细胞中miRNA-340、miRNA-27、miRNA-128可加重小鼠EAE表型。

根据miRBase数据库，目前所发现的miRNAs已超过700个，随着高通量测序的应用，将会有更多的新的miRNAs被发现。可能近90％的人类基因受到miRNAs调控，然而，当过表达或抑制某一个miRNA时，在发生调变的众多基因当中寻找并鉴定其中起关键作用的靶基因仍然具有相当大的挑战。目前鉴定miRNA靶基因的常用策略是利用生物信息学软件预测，主要根据已证实的miRNA及其靶基因序列之间相互作用的规律性，遵循几个常用原则设计的软件完成,如miRanda,TargetScan和TargetScanS,RNAhybrid,DIANA-microT,PicTar,及FindTar等。此外，利用蛋白质质谱来寻找miRNA靶基因也成为一种新的途径。

由于计算机模拟在预测miRNA靶基因时存在一定的局限性，利用生物学实验方法可以更加直观地寻找miRNA靶基因。目前主要是从mRNA水平与蛋白质水平来寻找靶基因。从mRNA水平来寻找靶基因主要是通来在细胞内过表达miRNA后，利用基因芯片分析mRNA的变化以找出相应miRNA的靶基因。这种方法由于miRNA所介导的转录后翻译抑制过程不引起mRNA水平的改变，因此依据mRNA水平的变化寻找miRNA靶基因的方法在检出率上存在一定问题。