[发明专利]一种石斛单细胞悬浮培养的方法

权利要求书

1.一种细胞培养液，其特征在于：按重量份数，总量为1000份，包括如下组分：100～120份1/2MS、1.1份 MES、30份蔗糖、100份葡萄糖、100份甘露醇、1.48份CaCl₂、1份BSA、土壤滤液20～25份，余量为超纯水；所述土壤滤液制备方法为：取普通土壤浸泡于蒸馏水中24h，浸泡后过滤，将滤液以3000rpm离心5min，取上清液，将上清液再以10000rpm离心5min，再次提取上清液，过滤，即得；所述土壤滤液的上清液过滤时，过滤孔径为0.45μm。

2.权利要求1所述细胞培养液在培养石斛细胞中的应用。

3.一种以权利要求1所述细胞培养液培养石斛细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）石斛预处理：破碎石斛，消毒、洗净；

（2）制备甘露醇培养液，所述甘露醇培养液按重量份数，总量为1000份，包括如下组分：100～120份1/2MS、1.1份 MES、30份蔗糖、100份葡萄糖、100份甘露醇、1.48份CaCl₂、1份BSA，余量为超纯水；将步骤（1）预处理后的石斛置于甘露醇培养液中，按重量比，石斛：甘露醇培养液=1～3：50，4℃暗处理1h；

（3）将暗处理后的石斛取出置于酶液中，黑暗震动酶解4h，按质量比，所述石斛：酶液=0.1～2:11；所述酶液的组分按重量份数为：39份MES、149份KCl、729份甘露醇、100份纤维素酶、40份果胶酶、50份离析酶、10份牛血清白蛋白、11.1份CaCl₂；将所述酶液各组分完全溶解于水中，混匀并经0.22μm过滤后，即得酶液；

（4）将酶解出的石斛细胞清洗和重悬3～5次，得纯化石斛单细胞悬液；

（5）将上述纯化石斛单细胞悬液加入权利要求1所述细胞培养液中，按体积比，所述纯化石斛单细胞悬液：细胞培养液 = 1:20，室温下100rpm摇床培养至细胞增殖即可。

4.根据权利要求3所述细胞培养液培养石斛细胞的方法，其特征在于：步骤（1）的消毒方法为：将所述石斛置于浓度为75%的酒精中浸泡15s，再放入0.1%升汞溶液中浸泡10min。

5.权利要求1所述细胞培养液在冻存石斛细胞中的应用。

6.一种利用权利要求1所述细胞培养液制备的石斛细胞冻存液，其特征在于：由所述细胞培养液和甘油按体积比为9:1组成。

7.一种利用权利要求1所述细胞培养液冻存石斛细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）制备细胞冻存液：将所述细胞培养液和甘油按体积比为9:1混匀制得；

（2）使用所述细胞冻存液将石斛细胞进行重悬，重悬后石斛细胞浓度为1～3×10⁶个/mL；

（3）将重悬后的石斛细胞4℃处理15min～30min，再在-80℃条件下处理24～720h，得冷冻处理后的石斛细胞；

（4）将所述冷冻处理后的石斛细胞迅速转入液氮中，封存，即冻存完成。

8.根据权利要求7所述冻存石斛细胞的方法，其特征在于：步骤（3）进行4℃处理后，先用棉花包裹在装有重悬后石斛细胞的容器外壁，再进行-80℃处理。

9.一种复苏权利要求7或8所冻存的石斛细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）取出冻存的石斛细胞，快速放入37℃水浴加热环境并加热至冻存液完全融化，得初步复苏的石斛细胞；

（2）使用所述细胞培养液重悬初步复苏的石斛细胞，重悬后细胞浓度为1～3×10⁶个/mL，得石斛细胞悬液；

（3）将所述石斛细胞悬液放入所述细胞培养液中，石斛细胞悬液与细胞培养液的体积比为1:40，室温下摇床培养至细胞增殖，即完成石斛细胞的复苏工作。