[发明专利]一种石斛单细胞悬浮培养的方法

说明书

本发明属于植物细胞生物工程领域，具体涉及一种石斛单细胞悬浮培养的方法。包括一种细胞培养液，及用该细胞培养液培养石斛细胞的方法。细胞培养液的组分为：1/2MS、MES、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、CaCl₂、1gBSA、土壤滤液，超纯水定容至1L；土壤滤液制备方法为：取普通土壤浸泡于蒸馏水中24h，浸泡后过滤，将滤液以3000rpm离心5min，取上清液，将上清液再以10000rpm离心5min，再次提取上清液，并将该上清液过滤即得。

技术领域

本发明属于植物细胞生物工程领域，具体涉及一种石斛单细胞悬浮培养的方法。

背景技术

石斛为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)植物，其茎段为传统中药材，在《中华人民共和国药典(2015年版)》等中皆有收录。在《神农本草经》中,石斛被列为上品,具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效。现代药理研究表明,其化学成分类型主要有生物碱类、酚类、多糖类等,其中生物碱类为主要成分。石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、抗白内障和抗菌等作用。因此，现代中医药界对石斛的研究逐渐重视起来。

植物细胞的单细胞悬浮培养技术能够在短时间内获得大量的植物细胞，目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作。另一方面，大量获得的具有相同遗传背景的植物悬浮培养细胞，可以为植物次生代谢产物的获取，以及植株的再生提供大量优质的原材料。

以往对石斛细胞悬浮培养的报道，都只集中于对石斛原球茎进行悬浮培养，缺乏对石斛的单细胞悬浮培养研究。这主要是因为使用原球茎进行悬浮培养相对容易，如果直接选取石斛成体的一部分(如茎段、叶片等)分离并培养单细胞，缺乏相关文献报道支持，而不同植物的单细胞培养方法不尽相同，直接将其它植物的细胞培养方法移植过来，石斛单细胞的提取率、存活率都非常低，即使存活，后续生长效果也不理想，无法在短时间内快速获得大量细胞并加以利用。

因此，研发一种存活率和获得率高的悬浮培养石斛单细胞的方法，对石斛进一步的科学研究、次生代谢产物生产、大规模无性繁育等，具有重要的科研价值和现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种悬浮培养石斛单细胞的方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种细胞培养液，按重量份数，总量为1000份，包括如下组分：100～120份1/2MS、1.1份MES、30份蔗糖、100份葡萄糖、100份甘露醇、1.48份CaCl₂、1份BSA、土壤滤液20～25份，余量为超纯水；所述土壤滤液制备方法为：取普通土壤浸泡于蒸馏水中24h，浸泡后过滤，将滤液以3000rpm离心5min，取上清液，将上清液再以10000rpm离心5min，再次提取上清液，过滤，即得。

优选的，所述土壤滤液的上清液过滤时，过滤孔径为0.45μm。

相应的，所述细胞培养液在培养石斛细胞中的应用。

相应的，一种以所述细胞培养液培养石斛细胞的方法，包括如下步骤：

(1)石斛预处理：破碎石斛，消毒、洗净；

(2)按权利要求1的方法制备不含土壤滤液的细胞培养液，得甘露醇培养液；将所述预处理后的石斛置于甘露醇培养液中，按重量比，石斛：甘露醇培养液＝1～3：50，4℃暗处理1h；

(3)将暗处理后的石斛取出置于酶液中，黑暗震动酶解4h，按质量比，所述石斛：酶液＝0.1～2:11；所述酶液的组分按重量份数为：39份MES，149份KCl，729份甘露醇，100份纤维素酶，40份果胶酶，50份离析酶，10份牛血清白蛋白，11.1份CaCl₂；将所述酶液各组分完全溶解于水中，混匀并经0.22μm过滤后，即得酶液；

(4)将酶解出的石斛细胞清洗和重悬3～5次，得纯化石斛单细胞悬液；