[发明专利]重组PRESCISSION酶在大肠杆菌中的生产方法

权利要求书

1.重组PRESCISSION酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、PGEX-4T-1-PRESCISSION蛋白酶表达质粒的构建；

S2、PRESCISSION蛋白酶的诱导表达与鉴定；

S3、PRESCISSION蛋白酶的纯化与鉴定。

2.根据权利要求1所述的重组PRESCISSION酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，所述的步骤S1，具体分如下步骤：

a、根据密码子优化后的基因序列，PRESCISSION蛋白酶直接进行基因合成；

b、将PGEX-4T-1载体质粒通过酶切进行线性化，线性化产物与基因合成产物进行无缝构建，形成重组产物；

c、取20ul重组产物转移到TOP10感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入600ul LB液体培养基，37℃、200rpm条件下摇床培养45min，涂布于含50ug/mL氨苄青霉素的LB平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；

d、使用灭菌牙签从LB平板上随机挑取四个菌落，接入4ml含氨苄青霉素抗性的LB培养基中；37℃、200rpm条件下摇床培养过夜，抽提质粒并Sanger法测序。

3.根据权利要求2所述的重组PRESCISSION酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，所述的步骤S2，具体分如下步骤：

a、将步骤S1中经过Sanger法测序结果鉴定为阳性的PGEX-4T-1-PRESCISSION蛋白酶质粒转入感受态BL21(DE3)中，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜；

b、使用灭菌牙签挑取LB平板上单菌落置于含氨苄青霉素抗性的LB培养基中，37℃、220rpm条件下培养过夜，以体积比1:100的比例接菌液于4ml含氨苄青霉素的LB培养基中，继续培养2.5h，OD600nm达到0.6～0.8时加入IPTG至0.5mM/L，于15℃过夜诱导蛋白表达；

c、取诱导表达的2ml菌液，在12000rpm条件下离心1min收集菌体，加入100ul的1×蛋白电泳缓冲液，煮沸5min，冷却后12000rpm条件下离心1min，取10ul菌体电泳缓冲液样品进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶利用快速染色仪染色脱色10min，观察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示在诱导表达后的菌体中出现与PRESCISSION蛋白酶理论分子量一致的表达条带，而诱导前的菌体中没有该条带存在，证明了PRESCISSION蛋白酶表达正常。

4.根据权利要求3所述的重组PRESCISSION酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，所述步骤S3，具体分如下步骤：

a、将S2-a步骤中过夜培养已转入PGEX-4T-1-PRESCISSION蛋白酶质粒的BL21(DE3)菌液以体积比1:100的比例接于800ml含氨苄青霉素LB中，37℃、220rpm条件下培养2h左右，OD600nm达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mM/L，于15℃过夜诱导蛋白表达，8000rpm离心10min，收集菌体，-20℃保存；

b、将-20℃冻存菌体加入细胞裂解液(比例为：1g菌体对应5mL细胞裂解液)，使用超声波破碎仪，低温条件下超声3秒，停10秒，共运行10分钟进行破菌，4℃、16000rpm条件下离心15min，分离上清液与沉淀；

c、分别取上清液、沉淀，并采用SDS-PAGE法进行检测，检测结果为破碎后上清和沉淀中均有与PRESCISSION蛋白酶理论分子量一致的条带，上清中含有80％以上蛋白酶，说明破碎结果良好；

d、将S3-b步骤中分离的上清液，置于干净的50ml的离心管中加入2ml GST柱，4℃孵育2h，先用细胞裂解液100ml进行清洗，再用含有20mM/L还原型谷胱甘肽的细胞裂解液5ml进行洗脱，最后将洗脱液以PRESCISSION蛋白酶储存液作为流动相过分子筛Superdex 75，根据280nm紫外吸收值收集目的蛋白的洗脱液，将目的蛋白液用12％的SDS-PAGE进行检测，从而制得纯化的PRESCISSION蛋白酶。

5.根据权利要求4所述的重组PRESCISSION酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，在步骤S3-b、S3-d中，所述细胞裂解液中含有20mM/L的三羟甲基氨基甲烷、300mM/L的氯化钠、重量百分比为10％的甘油，所述细胞裂解液PH为8.0。