[发明专利]重组PRESCISSION酶在大肠杆菌中的生产方法

说明书

本发明公开了重组PRESCISSION酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：S1、PGEX‑4T‑1‑PRESCISSION蛋白酶表达质粒的构建；S2、PRESCISSION蛋白酶的诱导表达与鉴定；S3、PRESCISSION蛋白酶的纯化与鉴定。本发明应用大肠杆菌表达系统，通过设计表达载体，实现重组PRESCISSION蛋白酶在大肠杆菌中表达，再经过亲和层析、Superdex 75凝胶过滤层析等方法对目标蛋白酶进行提纯，大幅缩短了目标蛋白酶的纯化流程与纯化时间，同时提高了蛋白酶的纯度、得率和酶活，节省实验步骤并减少成本。本发明方法，为研发及生产其他蛋白类工具酶奠定了基础。

技术领域

本发明涉及聚合物反应领域，具体为重组PRESCISSION酶在大 肠杆菌中的生产方法。

技术背景

目前，蛋白产量及活性不高是异源蛋白表达尤其是毒性蛋白表达 的技术瓶颈。随着生物技术的发展，研究者应用融合表达策略克服毒 性及难溶性蛋白的表达难关。

PRESCISSION蛋白酶具有高度酶切特异性，识别位点为 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln Gly-Pro，能特应性地切割Gln-Gly之间的肽 键,PRESCISSION蛋白酶全长546bp左右，编码的蛋白质相对分子 质量约为19997。鉴于此特异性，本研究通过基因工程方法构建重组 PRESCISSION蛋白酶以开发一种新型的工具酶。利用NCBI数据库 查找人鼻病毒PRESCISSION蛋白酶的氨基酸序列，通过生物工具网 站将其优化为适用于大肠杆菌表达的基因序列，直接合成并整合到表 达载体中，表达并纯化获得高纯度的PRESCISSION蛋白酶。该蛋白 酶能特应性地切割含PRESCISSION蛋白酶切位点的融合蛋白，具有 良好的生物学活性，为开发新的基因工程工具酶奠定了良好的基础。

PRESCISSION蛋白酶能特应性地切割含PRESCISSION位点的 融合蛋白，PRESCISSION蛋白酶切位点常被用于客户融合蛋白标签 的切除，高纯度和高活性的PRESCISSION蛋白酶的研制成功将产生 一定的商业价值。

目前，市场上PRESCISSION蛋白酶，生物活性普遍较低，而且 常见的PRESCISSION蛋白酶生产方法，步骤繁琐，成本较高。因此， 研发一种重组PRESCISSION酶在大肠杆菌中的生产方法，实现高纯 度重组PRESCISSION蛋白酶的制备，从而节省实验步骤并减少成本，是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的在于：提供重组PRESCISSION酶在大肠杆菌中的 生产方法，以解决上述技术问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

重组PRESCISSION酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：

S1、PGEX-4T-1-PRESCISSION蛋白酶表达质粒的构建；

S2、PRESCISSION蛋白酶的诱导表达与鉴定；

S3、PRESCISSION蛋白酶的纯化与鉴定。

优选地，所述的步骤S1，具体分如下步骤：

a、根据密码子优化后的基因序列，PRESCISSION蛋白酶直接进 行基因合成；

b、将PGEX-4T-1载体质粒通过酶切进行线性化，线性化产物与 基因合成产物进行无缝构建，形成重组产物；

c、取20ul重组产物转移到TOP10感受态细胞中，冰上静置 30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入600ul LB液 体培养基，37℃、200rpm条件下摇床培养45min，涂布于含50ug/mL 氨苄青霉素的LB平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；