[发明专利]一种构建高效分泌表达人源肝素水解酶重组菌的方法在审
| 申请号： | 201810709044.X | 申请日： | 2018-07-02 |
| 公开（公告）号： | CN108841738A | 公开（公告）日： | 2018-11-20 |
| 发明（设计）人： | 康振;陈坚;原攀红;堵国成 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N1/19 | 分类号： | C12N1/19;C12N9/42;C12N15/81;C12R1/84 |
| 代理公司： | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 | 代理人： | 张勇 |
| 地址： | 214000 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 水解酶 肝素 构建 毕赤酵母表达系统 高效分泌表达 重组菌 人源 酶工程技术 分泌表达 发酵 | ||
1.一种高效分泌表达人源肝素水解酶重组菌，其特征在于，所述重组菌是以毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主，表达人源的肝素水解酶。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，肝素水解酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述肝素水解酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建方法包括：将核苷酸序列为SEQ ID NO.1的肝素水解酶基因连接到表达载体pPIC9K上，然后转化到毕赤酵母Pichia pastoris GS115中，筛选正确的转化子，即得重组毕赤酵母Pichia pastorisGS115/pPIC9K-HSE。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于，所述方法还包括在肝素水解酶基因上添加组氨酸标签。
6.一种发酵生产肝素水解酶的方法，其特征在于，包括利用权利要求1-4任一所述重组菌进行发酵生产。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法在发酵罐中，采用甲醇诱导策略发酵生产肝素水解酶。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵包括：将Pichia pastorisGS115/pPIC9K-HSE的种子液按照8％-12％的接种量接种到发酵罐中，温度控制在25-30℃、pH为5-6、500-1000r·min-1，通气量为2-4L·min-1，溶氧维持在30％-35％以上进行培养；培养至甘油耗尽，指数流加含有PTM1的30-50％(W·V-1)甘油溶液，控制转速在500-1000r·min-1补料8-16h，停止补料待甘油再次耗尽，控制转速在600-1000r·min-1并流加甲醇进行诱导培养。
9.权利要求1-4任一所述重组菌的应用。
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