[发明专利]一种构建高效分泌表达人源肝素水解酶重组菌的方法

说明书

本发明公开了一种构建高效分泌表达人源肝素水解酶重组菌的方法，属于酶工程技术领域。本发明采用毕赤酵母表达系统，构建一种表达肝素水解酶的方法，在毕赤酵母表达系统中实现了肝素水解酶的分泌表达。本发明是一种发酵产肝素水解酶的方法，对肝素水解酶的工业化生产起到了重要的推动作用。

技术领域

本发明涉及一种构建高效分泌表达人源肝素水解酶重组菌的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

多糖作为一种高分子碳水化合物，广泛存在于动植物和微生物，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、免疫调节等多种生物学活性。多糖主要有二糖单位组成，分为硫酸乙酰肝素、肝素、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素。多糖裂解酶主要以β消除的方式裂解肝素或硫酸乙酰肝素，主要来源于肝素黄杆菌，目前从中分离纯化出三种肝素水解酶：肝素水解酶I、II、III，在低分子肝素制备及肝素类多糖分子结构解析领域具有十分重要的应用前景。对于包括肝素水解酶在内的几乎所有多糖裂解酶，催化方式的单一性很大程度限制了其相应的应用。然而，对于这种催化底物的单一性，目前的理解仅限于推测，尚无直接的实验证据，更无法实现不同结构多糖裂解酶间底物谱的转化。

肝素水解酶是内切-β-葡萄糖醛酸酶属于糖苷水解酶家族79，这种酶水解硫酸肝素，水解葡糖醛酸和氨基葡萄糖间的β1,4-糖苷键。肝素水解酶在癌细胞中过表达是众所周知的，与血管生成、炎症和增加的转移潜能有关，因此，肝素水解酶是一种重要的潜在药物目标。在35年前，Hook和他的同事们首先描述了一种硫酸乙酰肝素(HS)内切-β-D-葡糖醛酸糖苷酶，此后，陆续报道了这种活性存在各种细胞类型和组织。肝素水解酶在几乎所有分析的人类肿瘤中都过表达，并且在肿瘤细胞的过表达与转移潜能之间观察到相关性。它似乎也是小鼠β细胞存活和自身免疫性糖尿病的关键。因此，肝素水解酶被认为对肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要意义，成为抗癌药物发现的理想靶标。

目前生产肝素水解酶的方法为E.coli BL21，产量未报导，存在的问题为胞内表达未实现高效分泌表达等。

发明内容

为了解决上述问题，本发明重组表达了来源于人的肝素水解酶，实现了人源肝素水解酶的高效分泌表达，酶活可达585U/mL。

本发明的第一个目的是提供一种高效分泌表达人源肝素水解酶重组菌，所述重组菌是以毕赤酵母Pichia pastoris GS115为宿主，表达人源的肝素水解酶。

在本发明的一种实施方式中，所述肝素水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述肝素水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种所述重组菌的构建方法，包括：将核苷酸序列为SEQ ID NO.1的肝素水解酶基因连接到表达载体pPIC9K上，然后转化到毕赤酵母Pichiapastoris GS115中，筛选正确的转化子，即得重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115/pPIC9K-HSE。

在本发明的一种实施方式中，所述方法，还包括在肝素水解酶基因上添加组氨酸标签。

本发明的第三个目的是提供一种发酵生产肝素水解酶的方法，包括利用所述重组菌进行发酵生产。

在本发明的一种实施方式中，所述方法在发酵罐中，采用甲醇诱导策略发酵生产肝素水解酶。