[发明专利]自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法

说明书

本发明提供一种自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，包括：取人脂肪间充质干细胞经过原代分离培养和传代培养后，进行无血清化，获得多代培养的无血清培养液和多代培养的传代干细胞；合并多代培养的传代干细胞，离心收集得到干细胞上清液；并且，合并所述多代培养的无血清培养液，得到合并培养液；将所述合并培养液和所述细胞上清液混合，再与无血清培养液混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖。本发明通过自身的脂肪干细胞代替异基因外周血造血干细胞，作为自身造血干细胞的稳定的来源，方法简单，费用低，大大提高了造血干细胞总数，从而满足了临床的需求。

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，具体地说，涉及一种自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法。

背景技术

干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

外周造血干细胞移植已成为治疗恶性血液病、淋巴瘤和乳腺瘤等实体瘤的有效方法，尤其多用在多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤和乳腺癌等实体瘤的治疗。1990年以来，自体造血干细胞移植的数量已超过异基因移植。1993年以后，自体外周血干细胞移植的数量又超过了自体骨髓移植。1990～1994年，用于淋巴瘤和乳腺癌患者的自体造血干细胞移植增加了5倍，同期外周血干细胞移植的百分比也由15％增至75％，成为造血干细胞的主要来源，异基因PBSCT病例迅速增加。我国自1995年异体PBSCT成功以采，发展也极为迅速。

但是目前最主要的问题是造血干细胞的数目问题。由于外周血造血干细胞在外周血单个核细胞中的比例低，能够采集到的造血干细胞总数十分有限，不能满足临床需求。但异基因外周血造血干细胞移植存在来源不稳定，费用较高等因素。因而。目前的促进自体外周血造血干细胞的增殖的方法有待改进。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供了一种自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖方法，包括如下步骤：

取人脂肪间充质干细胞经过原代分离培养和传代培养后，进行无血清化，获得多代培养的无血清培养液和多代培养的传代干细胞；

合并多代培养的传代干细胞，离心收集得到干细胞上清液；并且，合并所述多代培养的无血清培养液，得到合并培养液；

将所述合并培养液和所述细胞上清液混合，再与无血清培养液混合，作为外周血干细胞培养基进行培养，以进行自体脂肪干细胞共培养促进外周血造血干细胞增殖。

优选地，所述无血清化，包括：

取传代培养的P3-P30代人脂肪间充质干细胞，利用细胞生长培养液培养至细胞80％融合时，弃去其中所述细胞生长培养液；

用磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次，加入无血清培养液培养72小时；

收集得到多代培养的无血清培养液和多代培养的传代干细胞

优选地，所述细胞生长培养液为无血清MSCM培养液。

优选地，所述传代培养中所使用的消化液为0.05％胰蛋白酶-0.25％EDTA混合消化液。

优选地，所述消化液的配制方法，包括：

取0.25g胰蛋白酶粉、20mgEDTA粉末和100ml 0.01mol/L的PBS；

用PBS溶解胰蛋白酶粉，然后将EDTA粉末和其余的PBS加入混合后，置于37℃水浴中，待彻底溶解液体呈透明为止；