[发明专利]一种石斑鱼重组神经肽Y的融合表达载体、制备方法以及其本身

权利要求书

1.一种石斑鱼重组神经肽Y的融合表达载体，由ecNPY成熟肽核酸序列和载体pET-SUMO连接构建，所述ecNPY成熟肽核酸序列插在SUMO剪切位点，并且所述ecNPY成熟肽核酸序列3′端引入终止密码子；

其中，所述ecNPY成熟肽具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，

所述载体pET-SUMO具有如SEQ ID NO.15所示的核酸序列。

2.一种高纯度石斑鱼重组神经肽Y的制备方法，包括：

(1)构建如权利要求1所述的重组神经肽Y的融合表达载体；

(2)重组表达载体可溶性表达，以及蛋白分离；

(3)利用SUMO自带的组氨酸标签，采用镍柱亲和层析蛋白纯化得到融合蛋白SUMO-ecNPY；

(4)酶切步骤(3)得到的融合蛋白；

(5)再纯化步骤(4)酶切后的融合蛋白，得到ecNPY蛋白。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(2)，使用IPTG诱导载体宿主，在25℃-30℃培养表达。

4.根据权利要3所述的制备方法，其中步骤(2)，使用IPTG诱导载体宿主，在25℃培养表达。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(3)的具体工艺为，

1)将镍离子琼脂糖亲和层析介质装柱后，用5倍柱体积的0.5mol/L NaOH溶液活化柱子，流速为5mL/min，柱床体积为20m；

2)用5倍柱体积的ddH₂O洗去NaOH溶液，此时亲和层析仪的Cond％＝0；5倍柱体积的NiSO₄过柱子，使亲和介质吸附Ni²⁺至Cond％平稳；ddH₂O清洗去未结合Ni²⁺，洗至Cond％＝0；使用Balance Buffer平衡柱子，至Cond％平稳，此时将流速改为3mL/min；

所述Balance Buffer含20mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄,pH7.4,500mmol/L NaCl,5mmol/L咪唑；

3)将总蛋白溶液上样，控制其流速为1mL/min，用5倍柱体积的Balance Buffer清洗，至280nm波长吸收值稳定，再用100mmol/L咪唑溶液清洗去除非特异性结合杂蛋白；

4)用500mmol/L咪唑溶液洗脱，收集样品峰对应洗脱液，即得到融合蛋白。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(4)的具体工艺为，按照体积1:1，将步骤(3)得到的含融合蛋白的洗脱液加入Balance Buffer，然后测定蛋白浓度，加入SUMOProtease，使得SUMO Protease终浓度在200U/mg蛋白，4℃酶切20h。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其中步骤(5)的具体工艺为，

Ⅰ将镍离子琼脂糖亲和层析介质装柱后，用5倍柱体积的0.5mol/L NaOH溶液活化柱子，流速为5mL/min，柱床体积为20m；

Ⅱ用5倍柱体积的ddH₂O洗去NaOH溶液，此时亲和层析仪的Cond％＝0；5倍柱体积的NiSO₄过柱子，使亲和介质吸附Ni₂+至Cond％平稳；ddH₂O清洗去未结合Ni₂+，洗至Cond％＝0；使用Balance Buffer平衡柱子，至Cond％平稳，此时将流速改为3mL/min；

所述Balance Buffer含20mmol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH7.4,500mmol/L NaCl，5mmol/L咪唑；

Ⅲ用步骤(4)得到的酶切后的蛋白溶液上样，控制流速在1mL/min，收集流穿液，即得ecNPY蛋白。