[发明专利]一种石斑鱼重组神经肽Y的融合表达载体、制备方法以及其本身

说明书

本发明提供了一种石斑鱼重组神经肽Y的融合表达载体、制备方法以及其本身。包括构建表达斜带石斑鱼ecNPY的基于pET‑SUMO的融合表达载体，并优化出实现高效的可溶性表达的最佳条件，且优化出融合蛋白酶切释放出目的肽的最佳条件，从而获得高纯度的无任何额外氨基酸的重组石斑鱼NPY(r‑ecNPY)。并证明r‑ecNPY具有较强的生物学活性，同时证明序列来源于石斑鱼的r‑ecNPY能够在鲤鱼中发挥生物学效应，显示了广泛的应用价值。

技术领域

本发明涉及具有促进动物摄食及生长发育的活性多肽领域，具体涉及一种重组神经肽Y的制备方法。

背景技术

我国海水养殖产业不断发展，其中石斑鱼养殖规模在近5年增长迅速，2016年产量达10.83万吨[农业部渔业渔政管理局.2017中国渔业统计年鉴.中国农业出版社]，成为南方重要的海水养殖鱼类，从曾经的名贵海鲜变成如今普通家庭也能消费的水产品，这主要得益于苗种繁育技术的不断突破，学术界与养殖产业界对此贡献巨大。但养殖产业的健康持续发展尚需进一步改进养殖技术，促进养殖鱼类的摄食、生长、抗病力以进一步提高养殖效益。但目前石斑鱼人工养殖中还没有一种能够有效促进其生长的基因工程产品饵料添加剂。

神经肽Y(Neuropeptide Y，NPY)是1982年Tatemoto首次从家猪大脑中分离出的一种多肽，该多肽的天然构象为发卡型，在肽链中存在许多酪氨酸，因此它也被称为神经肽酪氨酸[Tatemoto K et al.Neuropeptide Y:a noval brain peptide with structuralsimilarities to peptide YY and pancreatic polypeptide.Nature,1982,296(5858):659-660]。npy基因编码由约98个氨基酸组成的NPY前体，NPY前体储存于神经纤维的分泌囊泡中，经酶解释放为有活性的NPY成熟肽[施广璞等.神经肽Y的基因及其表达调控.国外医学:分子生物学分册,1994,16(3):139-142]。NPY是一种内源性促食因子，属于胰多肽家族成员，与两种消化系统内分泌肽(胰腺肽和肽YY)同源，在不同种类的鱼类中同源性也较高。NPY具有2个相互逆平行的螺旋结构，螺旋区都具有两性电离特点，2个螺旋之间借疏水作用维持其稳定的三级结构。当NPY的三级结构发生改变时，其生物活性即减弱甚至丧失。NPY广泛表达与中枢及外周神经系统中，同时也存在与心脏、肝脏、骨骼肌、肾上腺等器官中。大量研究表明，哺乳动物NPY能够刺激摄食，改变机体代谢，激活脂肪组织的脂肪酶，促进脂肪的合成与储存。在鱼类，NPY除了同样能够促进摄食，并能够促进生长发育，调节繁殖等生理过程，还能够促进鱼体免疫机能[Zukowska Z,et al.Neuropeptide Y:a new mediatorlinking sympathetic nerves,blood vessels and immune system.Canadian Journalof Physiology and Pharmacology,2003,81(2):89-94.]，因此NPY在水产养殖上具有较大的应用潜力。

NPY的获取可通过天然提取、化学合成和基因工程技术重组表达3种途径。前两种得率低、价格贵，无法满足大规模生产饲料添加剂的需求，基因工程技术重组表达NPY是必须探索之路。目前已有基因工程重组表达哺乳动物和鱼类NPY的报道，但存在一系列问题，主要是：(1)目的肽NPY均带有标签或其他额外氨基酸，如融合表达的组氨酸标签、起分子伴侣作用的融合蛋白切除不能刚好在目的肽和融合蛋白之间切除以使目的肽不带任何额外氨基酸；(2)容易形成包涵体，而不能够获得稳定的可溶性表达；(3)酵母表达系统的表达量较低，且存在分泌到胞外过程中信号肽序列不能有效切除或目的肽被降解等问题。这些问题都都影响了NPY的活性、制备过程的稳定性及大规模制备等。

发明内容

本发明的目的是根据现有技术的不足，提供一种神经肽ecNPY(石斑鱼NPY)重组融合表达载体，ecNPY表达方法，以及后续的纯化、酶切等工艺。

根据本发明的一方面，构建ecNPY的最优重组表达载体。