[发明专利]人羊膜来源的间充质干细胞预处理方法及其应用

权利要求书

1.人羊膜来源的间充质干细胞预处理方法，其特征在于包括：

分别对AMSC和AEC分离传代培养，收集P10代内的AMSC和P5代内的AEC；

将P10代内的AMSC和P5代内的AEC进行间接共培养处理；或将P3代内的AEC用于制备条件培养基后用于P10代内的AMSC进行条件培养；

收集处理后的AMSC，得预处理后的AMSC。

2.如权利要求1所述的人羊膜来源的间充质干细胞预处理方法，其特征在于，所述AMSC和AEC分离传代培养还包括纯化及扩增处理。

3.如权利要求2所述的人羊膜来源的间充质干细胞预处理方法，其特征在于，所述AMSC的分离传代培养、纯化及扩增处理包括：

取材并接种，接种完毕后，加入完全DMEM/F12培养基，置于湿度培养箱中静置培养；待组织块略干燥，能牢固贴在瓶壁上时，使培养液缓缓浸润组织块，静置培养；

24h后补足完全培养基，3～5天后换液并去除未贴壁的漂浮的组织块，当后细胞生长密度达到80～90％融合时进行传代培养；

去掉组织块，吸去组织块和陈旧培养液，用平衡盐溶液清洗后，向培养瓶中加入0.125％胰蛋白酶液室温下消化；

待细胞胞体回缩、变圆，细胞间隙变大但并未脱离瓶壁时，加入新生牛血清原液终止消化；

脱落瓶壁上的细胞形成细胞悬液，离心处理，

弃上清，加完全DMEM/F12培养基重悬细胞，将细胞接种到培养瓶中，再补加完全DMEM/F12培养基，标记为P1代，置培养箱中培养；

当贴壁细胞彼此融合达80～90％时，再重复上述操作，按1:2或1:3进行传代接种；

收集P10代以内AMSC。

4.如权利要求2所述的人羊膜来源的间充质干细胞预处理方法，其特征在于，所述AEC的分离传代培养、纯化及扩增处理包括：

取数块羊膜组织到离心管中，加入0.125％胰酶，置于37℃温箱中消化，以血清终止消化，收集3次消化的液体，过滤离心处理；

用完全DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，并补加完全DMEM/F12培养基；待贴壁细胞彼此融合达80～90％，倒掉陈旧培养液，用平衡盐溶液清洗后，向培养瓶中加入胰蛋白酶液，室温下消化；

待细胞胞体回缩、变圆，细胞间隙变大但并未脱离瓶壁时，加入新生牛血清原液终止消化，脱落瓶壁上的细胞使形成细胞悬液离心处理；弃上清，加完全DMEM/F12培养基重悬细胞，将细胞接种到培养瓶中，再向补加完全DMEM/F12培养基，标记为P1代，置培养箱中培养；

当贴壁细胞彼此融合达80～90％时，再重复上述操作，按1:2或1:3进行传代接种；

收集P5代以内AEC。

5.如权利要求1所述的人羊膜来源的间充质干细胞预处理方法，其特征在于，所述将P10代内的AMSC和P5代内的AEC进行间接共培养处理包括：

分别取P10代内的AMSC和P5代内的AEC，分别吸出各自培养瓶内陈旧培养基，并均用平衡盐溶液液洗后消化，待AMSC和AEC各自的细胞胞体回缩、变圆后，均立即终止消化，将细胞转移离心管离心处理后弃去上清液，用不含血清的单DMEM/F12培养基重悬细胞；

将处理好的AMSC放入悬挂式培养皿中，将处理好的AEC接种至所述悬挂式培养皿中并放置至培养箱内进行间接共培养；

于24h～72h后弃去悬挂式培养皿将AMSC取出，消化收集，得预处理后的AMSC。