[发明专利]人羊膜来源的间充质干细胞预处理方法及其应用

说明书

本发明公开了人羊膜来源的间充质干细胞预处理方法，包括：分别对AMSC和AEC分离传代培养，收集P10代内的AMSC和P5代内的AEC；将P10代内的AMSC和P5代内的AEC进行间接共培养处理；或将P3代内的AEC用于制备条件培养基后用于P10代内的AMSC进行条件培养；收集处理后的AMSC，得预处理后的AMSC，本发明的方法能保持AMSC稳定的细胞学特征及良好的增殖活性，从而能保障临床应用所需MSC的质量和数量，增加AMSC归巢和体内的植入数量，从而能够满足治疗所需要的细胞数量；具有简便且由于价格低廉的特点，有效的降低了使用成本，同时，本方法安全性好，无明显毒副作用，对AMSC的临床应用和提高HSCT成功率及疗效具有重要的现实意义。

技术领域

本发明属于医学技术领域，涉及血液学技术领域，特别涉及一种人羊膜来源的间充质干细胞预处理方法及其应用。

背景技术

造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是血液系统恶性肿瘤、重型再生障碍性贫血、重症免疫缺陷病和部分遗传性疾病最有效的治疗手段之一。当前，我国仅白血病患者每年就新增4万人，正等待造血干细胞移植挽救生命的患者近百万人。而在HSCT后，干细胞的成活、分化、增殖及造血和免疫功能的恢复，直接影响治疗的效果。移植过程中难免会遇到诸多问题，如造血微环境的破坏，干细胞归巢及移植物抗宿主反应(graft versus host reaction,GVHR)均影响移植成败。因此，如何更好地提高HSCT成功率，是血液学工作者面临的重大课题。

近年来的研究发现间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是造血微环境的重要组成成分，临床联合移植MSC和HSC是提高造血重建能力、减少或减轻移植物抗宿主病(GVHD)发生的有效手段。但目前许多研究报道经静脉输注后MSC或基质细胞重建骨髓微环境的能力是非常有限的，而增加迁移到骨髓的MSC数量已被证实可以更好的提高临床疗效。因此，要使MSC移植获得良好的治疗效果，就要求我们找到一种切实有效的提高其归巢和植入的方法。

人羊膜MSC(amniotic MSC，AMSC)是一种来源丰富、无需有创操作、取材几乎不受限制，且分离培养方法简便的MSC新来源，不仅可以向成骨、脂肪、内皮等中胚层细胞分化，在适宜条件下还可以向神经、肝细胞等外胚层和内胚层细胞分化，体外具有与BMSC相似的支持造血功能，甚至可以表达比BMSC更为丰富的造血细胞因子，同时免疫原性低、能显著抑制淋巴细胞增殖，可能成为一种更加理想的MSC临床研究及应用的来源。SDF1/CXCR4轴在MSC迁移过程中发挥重要作用，以此为切入点，通过对AMSC的体外预处理提高其归巢能力，不仅将为AMSC应用于临床提供理论依据，也为更有效地提高移植疗效开辟新途径。同时，由于MSC经静脉注射后不仅向骨髓，还能够向其他损伤部位特异性地迁移，参与局部损伤修复，因此提高其迁移能力还可能为改善MSC治疗骨关节疾病、炎症性肠病、肝硬化、神经系统疾病等的疗效提供新思路。

目前开展的MSC临床试验多采用经静脉输注的方法，所需要的MSC数量较大，从0.4×10⁶/kg到10×10⁶/kg体重不等。尽管采用这样大剂量取得了较好的临床疗效，但MSC在体内植入的数量却仍然非常有限。例如Bartsch等报道，在BMSC与HSC联合移植后，受者的外周血和骨髓中的造血细胞都达到了100％的完全供者嵌合，而其MSC却仍保持着受者来源，未检测到供者来源MSC的长期植入。近来的研究证实，直接将MSC注射入骨髓腔能更好的促进造血恢复及减轻GVHD，