[发明专利]一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法

权利要求书

1.一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法，其特征在于：依次包括以下步骤：

(1)三明野生黄精外植体准备；

(2)三明野生黄精外植体消毒试剂的准备；

(3)三明野生黄精外植体消毒前处理；

(4)三明野生黄精的消毒与接种；

(5)三明野生黄精不定芽诱导培养基筛选；

(6)三明野生黄精污染情况统计及出芽个数统计。

2.根据权利要求1所述的一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法，其特征在于，步骤(1)所述的三明野生黄精外植体准备的方法为：选取冬季12月三明野生黄精块茎与春季3月的野生黄精植株进行外植体消毒时本身活力的对比试验，冬季野生黄精去除须根，春季野生黄精去除须根和地上叶；选色泽鲜黄，生活力较强的地下块茎为外植体，用软毛牙刷在清水下洗去野生黄精块茎表面的泥土，尤其是黄精块茎节间部分可以拨开分段仔细清洗，获得预消毒前干净的外植体。

3.根据权利要求1所述的一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法，其特征在于，步骤(2)所述的三明野生黄精外植体消毒试剂的准备方法为：a、采用配制好的1wt%HgCl₂母液，稀释成0.2wt%的浓度备用；b、采用多菌灵粉末配制3wt%的多菌灵溶液，作为消毒前外植体灭菌试剂备用。

4. 根据权利要求1所述的一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法，其特征在于，步骤(3) 三明野生黄精外植体预消毒处理方法为：将步骤(1)中获得的干净外植体进行不同的预消毒处理；具体为以下3种方法中的任意一种：a、采用3wt%多菌灵浸泡3 d，期间时常震荡摇晃，在清水下用软毛牙刷清洗块茎表面残留的多菌灵，盛放于瓷杯中，获得正式消毒前的外植体；b、不加多菌灵表面预消毒，将块茎按步骤(1)获得后晾干3 d，获得消毒前外植体备用；c、块茎按步骤(1)获得后，先用洗衣粉在自来水下开到最大，冲洗16 h，再用3wt%多菌灵浸泡2 d，期间时常震荡摇晃，在清水下用软毛牙刷清洗块茎表面残留的多菌灵，在滤纸上晾放5 h后进行外植体消毒。

5. 根据权利要求1所述的一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法，其特征在于，步骤(4)三明野生黄精的消毒与接种方法为：将预消毒处理或晾干获得的外植体分装于瓷杯中，采用不同的消毒组合和不同的接种方式进行无菌体系建立的优化；基础消毒步骤为：①将预消毒处理过的外植体置于紫外好的超净工作台上，用无菌水清洗2次；②用75wt%酒精浸泡30 s；③用0.2wt%HgCl₂浸泡15 min，同时滴一滴表面活性剂吐温20；④无菌水清洗4-5遍至干净；⑤将消毒好的块茎置于滤纸上，表面晾干；⑥接种于配制好的培养基中，切口处与培养基接触，每瓶培养基只接一块，春季材料块茎较小可适当接种3-4块；然后进行12 h黑暗12 h光照培养，及时观察污染情况；对消毒接种后的黄精每隔15 d进行污染率统计；

⑥中的接种方式为以下三种中的任意一种：A、未去除块茎表面的表皮，仅将块茎按节间大小切成的大小不一的小块进行野生黄精的初代消毒培养；B、结合预实验结果，切去块茎表面表皮，进行消毒培养；C、未切除块茎表面表皮，仅切除块茎节间拨开处与消毒剂接触的切面，根据块茎节间大小切成小块。

6.根据权利要求1所述的一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法，其特征在于，步骤(5)三明野生黄精不定芽增殖培养基为以下三种培养基中的任意一种：（1）MS+6-BA4 mg/L +NAA 0.2 mg/L+30 g蔗糖+7g琼脂 pH5.8；（2）MS+6-BA 2 mg/L +NAA 0.2 mg/L+30g蔗糖+7g琼脂 pH5.8；（3）MS+6-BA 10 mg/L +NAA 0.2 mg/L+30 g蔗糖+7g琼脂 pH5.8。

7.根据权利要求1所述的一种三明野生黄精无菌体系建立与芽诱导的方法，其特征在于，步骤(6)三明野生黄精污染情况统计及出芽个数统计具体为：每隔15 d对黄精培养过程中不定芽诱导数目进行出芽率统计。