[发明专利]一种玉米淀粉降解能力提高的嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶突变体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种玉米淀粉降解能力提高的嗜热酸性生淀粉α‑淀粉酶突变体及其制备方法和应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明对生淀粉α‑淀粉酶GTamy的SBD结构域进行环化重排突变，再将GTamy中SBD替换为SBD环化重排突变体，构建GTamy环化重排突变体。通过比较GTamy环化重排突变体对玉米淀粉的酶活力，筛选出玉米淀粉降解能力显著提高的生淀粉α‑淀粉酶突变体GTamy‑S498。本发明提供的生淀粉α‑淀粉酶突变体GTamy‑S498对玉米淀粉的酶活力由对照(突变前)的21.08U/mg提高到114.77U/mg，提高了5.44倍。生淀粉α‑淀粉酶突变体GTamy‑S498的玉米淀粉降解能力显著提高，并且其酶学性质符合淀粉液化工艺的需要，更适用于淀粉液化工艺。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种玉米淀粉降解能力提高的嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶突变体及其制备方法和应用。

背景技术

天然生淀粉是一种结构复杂而致密的颗粒，在应用前往往需要经过强酸、强碱、高温或者酶法处理来破坏生淀粉颗粒的结构。酶法降解生淀粉能够简化现代发酵工业中的生淀粉前处理过程，更加环保并节约能耗，因此生淀粉降解酶的研究一直受到高度关注。生淀粉酶是指能对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒表现出强水解活性的酶类。在α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶中均有部分酶具有水解生淀粉的能力。

生淀粉α-淀粉酶可以在低于糊化温度条件下直接作用于未经蒸煮糊化的生淀粉颗粒，在淀粉液化过程中能够省去生淀粉糊化步骤，有利于节约能源和简化工艺，因此生淀粉α-淀粉酶在酿造、食品、造纸、纺织等领域具有巨大的应用潜力。在淀粉双酶法水解工艺中为了防止杂菌污染需要适当加温，至少要达到60℃。此外，生淀粉加水形成的乳浊液的pH值一般为5.8～6.5，由于淀粉工业中循环工艺的应用，淀粉水解过程中的pH通常在5.0左右。因此，获得嗜热酸性和不依赖于Ca²⁺的生淀粉α-淀粉酶，有利于对现行淀粉加工工业的工艺体系进行技术升级和改造。

来源于嗜热菌Geobacillus thermoleovorans的α-淀粉酶GTamy属于嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶(Mehta D,Satyanarayana T,Biochemical and molecularcharacterization of recombinant acidic and thermostable raw-starchhydrolysing α-amylase from an extreme thermophile Geobacillus thermoleovorans[J].Journal of Molecular Catalysis B:enzymatic,2013,85:229-238.)，具有优良的高温活性和热稳定性，其最适反应温度为80℃，最适反应pH为5.0，于80℃的可溶性淀粉酶活达1723U/mg，于80℃的半衰期为184min，其活性和热稳定性均不依赖于Ca²⁺。GTamy是目前报道的玉米淀粉降解率最高的生淀粉α-淀粉酶，使用0.1U/(mg淀粉)的酶液，于80℃水解30％玉米淀粉3h(pH 5.0)，玉米淀粉降解率达54％。并且GTamy的酶学性质(如热稳定、低pH、不依赖于Ca²⁺)使得其在淀粉液化工艺中具有巨大的应用潜力。

GTamy应用于淀粉液化工艺中，可以在满足工业生产要求的前提下(30％玉米淀粉乳、反应时间3h、pH 5.0)，在低于淀粉糊化温度的条件下液化玉米淀粉，省去传统双酶法水解工艺中的糊化步骤，有利于简化工艺、节约能源。但是GTamy的玉米淀粉降解能力距离工业应用仍有一定的距离，例如0.1U/(mg淀粉)的酶液在以上条件下80℃处理玉米淀粉的降解率为54％，因此GTamy的玉米淀粉降解能力有待进一步提高。本发明拟采用基于蛋白质分子结构的环化重排方法对GTamy进行分子改造，来获得玉米淀粉降解能力提高的GTamy突变体。

发明内容