[发明专利]一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法及装置

权利要求书

1.一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，包括如下步骤：

步骤一，取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；

步骤二，以步骤一获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；

步骤三，对PCR扩增产物进行纯化；

步骤四，将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；

步骤五，选取饱满的单菌落接种于培养液中，并振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；

步骤六，将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；

步骤七，取步骤一中得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中产2-甲基异莰醇菌株的浓度。

2.如权利要求1所述的一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：于步骤二中，采用PCR反应体系为50μL，引物信息如下：上游引物序列为SEQ IDNO.1、下游引物序列为SEQ IDNO.2，反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃15秒，退火温度60℃45秒和72℃延伸40秒，进行45个循环，最终72℃延伸10分钟，并通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。

3.如权利要求1所述的一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：于步骤三中，利用DNA胶回收试剂盒进行胶回收，对PCR扩增产物进行纯化，并通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。

4.如权利要求1所述的一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：于步骤四中，将经步骤三纯化后的DNA插入质粒载体中，并进一步转化到DH5α感受态大肠杆菌溶液，然后涂布到加入Amp抗性的LB固体培养基上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。

5.如权利要求1所述的一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：于步骤五中，选取饱满的单菌落接种于含有Amp的液体LB培养液中，于37℃、180-200转/分钟振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析。

6.如权利要求1所述的一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于，步骤七进一步包括：

加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品；

进行实时定量PCR反应，进行PCR扩增；

反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，计算DNA样本的pgmts基因的拷贝数，从而得到原水中pgmts基因的拷贝数，并分析得到水样中pgmts基因的浓度。

7.如权利要求6所述的一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：于步骤七中，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃15；PCR反应，45个循环，95℃5秒，60℃45秒。

8.一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的装置，包括：

DNA样本提取单元，用于通过取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；

PCR扩增单元，以所述DNA样本提取单元获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；

纯化单元，用于对PCR扩增产物进行纯化；

质粒转化单元，用于将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；

鉴定分析单元，用于选取饱满的单菌落接种于培养液中，并振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；

标准曲线建立单元，用于将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；

定量PCR检测单元，用于取所述DNA样本提取单元得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中产2-甲基异莰醇菌株的浓度。