[发明专利]一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法及装置

说明书

本发明公开了一种定量检测产2‑甲基异莰醇菌株的方法及装置，该方法包括：取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；以获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；选取饱满的单菌落接种于培养液中振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品浓度与临界循环数对应的标准曲线；取之前得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中产2‑甲基异莰醇菌株的浓度。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法及装置。

背景技术

2-甲基异莰醇是水中常见的嗅味物质，主要由放线菌、真菌和蓝绿藻代谢产生，其在水中的嗅味阈值极低(10ng/L)。湖泊和水库的水体富营养化会产生嗅味物质，当水体发生富营养化后，在水体中可以检测到2-甲基异莰醇。广大消费者认为嗅味问题是影响饮用水水质的关键因素，产生异味不但影响人们的感官特征，甚至能对人的健康产生危害。嗅味问题已经在全球范围内产生了严重的影响，早在上世纪80年代的瑞士、芬兰、美国、加拿大、澳大利亚、英国、日本等国家均产生了严重的嗅味问题。我国随经济的发展对供水水质的要求也日益提高，此类问题近年来也已引起广泛的关注

众所周知，蓝藻水华时可产生2-甲基异莰醇，此过程在几天内就可迅速完成，因此，这就需要水质监测部门能够快速检测2-甲基异莰醇。常规条件下可通过人的感官、气相色谱和质谱联用法测定嗅味物质的含量。但这些方法都要耗费大量的时间、精力，错过了嗅味物质风险预警分析的最佳时机。因此，建立高灵敏度、高特异性的定量检测方法迫在眉睫。

发明内容

为克服上述现有技术存在的不足，本发明之目的在于提供一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法及装置，以快速准确的测定地表水中产2-甲基异莰醇菌株的浓度。

为达上述及其它目的，本发明提出一种定量检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，包括如下步骤：

步骤一，取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；

步骤二，以步骤一获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；

步骤三，对PCR扩增产物进行纯化；

步骤四，将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；

步骤五，选取饱满的单菌落接种于培养液中，并振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；

步骤六，将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；

步骤七，取步骤一中得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中产2-甲基异莰醇菌株的浓度。

优选地，于步骤二中，采用PCR反应体系为50μL，引物信息如下：上游引物5’-CGATTGGTCGGTATTAGAGGCT-3’(SEQ IDNO.1)、下游引物5’-ATCACGCGGTCATCAGGCTT-3’(SEQIDNO.2)，反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃15秒，退火温度60℃45秒和72℃延伸40秒，进行45个循环，最终72℃延伸10分钟，并通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。

优选地，于步骤三中，利用DNA胶回收试剂盒进行胶回收，对PCR扩增产物进行纯化，并通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。