[发明专利]一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法

权利要求书

1.一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品，其特征在于：所述标准品为包含pgmtc基因的重组质粒或重组细胞，所述pgmtc基因的序列为序列表SEQ IDNO.1中的序列。

2.如权利要求1所述的一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品，其特征在于：所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。

3.一种如权利要求1所述的标准品的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，针对pgmtc基因设计特异性的引物；

步骤二，取地表水水样，利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；

步骤三，以步骤二中的DNA样本为模板进行PCR扩增；

步骤四，对PCR扩增产物进行纯化；

步骤五，将纯化后的PCR扩增产物与质粒载体pMD18-T链接，获得转化了质粒的白色菌落；

步骤六，选取饱满的单菌落接种于培养液中培养过夜，并利用质粒提取试剂盒提取质粒，获得大量的质粒标准品，以用于菌液PCR鉴定和测序分析。

4.如权利要求3所述的标准品的制备方法，其特征在于：于步骤一中，下载pgmtc基因序列进行同源性比较分析，设计和合成特异性的引物，所述PCR产物长度为223bp，引物序列如下：上游引物为SEQ IDNO.2，下游引物为SEQ IDNO.3。

5.如权利要求3所述的标准品的制备方法，其特征在于：于步骤三中，采用反应体系为50μL，引物信息为：上游引物为SEQ IDNO.2，下游引物为SEQ IDNO.2，反应程序为：95℃预变性5分钟，随后95℃15秒，退火温度60℃45秒和72℃延伸40秒，进行45个循环，最终72℃延伸10分钟，并通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。

6.一种检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，包括如下步骤：

步骤一，以重组质粒为标准品模板，用实时定量PCR进行PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的标准曲线；

步骤二，用待测样品替换步骤一中的标准品，进行实时定量PCR扩增，根据扩增结果的临界循环数和标准曲线，得到待测样品中pgmtc基因的拷贝数，即得到所述待测样品中产2-甲基异莰醇菌株的数量。

7.如权利要求6所述的一种检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：所述实时定量PCR扩增的体系包括实时定量PCR扩增缓冲液、引物对和模板，所述引物对包括：上游引物为SEQ IDNO.2下游引物为SEQ IDNO.3，所述上下游引物在反应体系中的浓度均为0.1～0.3μM/L。

8.如权利要求7所述的一种检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：于步骤一中，将质粒标准品进行若干倍梯度稀释，作为定量PCR模板DNA，进行实时定量PCR扩增，按照试剂盒说明进行操作，加入实时定量PCR所需试剂，PCR反应体系为20μL，加入2μL质粒标准品作为反应模板，进行实时定量PCR反应，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃15秒；PCR反应，45个循环，95℃5秒，60℃45秒，以去离子水作为阴性对照，以标准品稀释梯度的对数值为横坐标，以临界循环数为纵坐标建立实时定量PCR的标准曲线。

9.如权利要求8所述的一种检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：所述标准品模板在所述实时定量PCR扩增的体系中的浓度为5.79×10²copies/μL、5.79×10³copies/μL、5.79×10⁴copies/μL、5.79×10⁵copies/μL、5.79×10⁶copies/μL和5.79×10⁷copies/μL中之一。

10.如权利要求7所述的一种检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，其特征在于：于步骤二中，取地表水水样，利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化，得到DNA样本作为待测样品，用待测样品替换步骤一中的标准品，进行实时定量PCR扩增，按照试剂盒说明进行操作，加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品，设立阴性对照和阳性对照，进行实时定量PCR反应，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃15秒；PCR反应，45个循环，95℃5秒，60℃45秒。