[发明专利]一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法

说明书

本发明公开了一种检测产2‑甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法，所述检测方法包括如下步骤：步骤一，以重组质粒为标准品模板，用实时定量PCR进行PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的标准曲线；步骤二，用待测样品替换步骤一中的标准品，进行实时定量PCR扩增，根据扩增结果的临界循环数和标准曲线，得到待测样品中pgmtc基因的拷贝数，即得到所述待测样品中产2‑甲基异莰醇菌株的数量，通过本发明，可实现水环境样品中产2‑MIB菌株的快速定量检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法。

背景技术

全球范围内都曾发生过水体嗅味问题。2-甲基异莰醇(2-MIB)是水中常见的嗅味物质，主要由放线菌、真菌和蓝绿藻代谢产生，其嗅阈值极低，在很低的浓度水平下即可感知到异味的存在(10ng/L)。2-MIB引起的嗅味问题对社会的影响是多方面的，会影响饮用水的饮用口感，降低饮用水和水产品的品质，引发饮用者厌恶、恶心等不愉快心理，同时也降低了湖泊水库的水环境美学价值。尽管没有研究直接指出，微生物产生的2-MIB对人体健康有何危害，但由于其特殊的气味，一旦水体出现嗅味问题，就会引起广大居民的投诉和关注。

众所周知，蓝藻水华时可产生2-甲基异莰醇，此过程在几天内就可迅速完成，因此，这就需要水质监测部门能够快速检测2-甲基异莰醇。常规条件下可通过人的感官、气相色谱和质谱联用法测定嗅味物质的含量。但这些方法都要耗费大量的时间、精力，错过了嗅味物质风险预警分析的最佳时机。因此，建立高灵敏度、高特异性的检测方法迫在眉睫。

发明内容

为克服上述现有技术存在的不足，本发明之目的在于提供一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法，以实现水环境样品中产2-MIB菌株的快速定量检测。

为达上述及其它目的，本发明提出一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品，所述标准品为包含pgmtc基因的重组质粒或重组细胞，所述pgmtc基因的序列为序列表SEQIDNO.1中的序列。

优选地，所述重组质粒中的出发质粒是pMD-18T。

为达到上述目的，本发明还提供一种上述标准品的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，针对pgmtc基因设计特异性的引物；

步骤二，取地表水水样，利用DNA提取试剂盒进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；

步骤三，以步骤二中的DNA样本为模板进行PCR扩增；

步骤四，对PCR扩增产物进行纯化；

步骤五，将纯化后的PCR扩增产物与质粒载体pMD18-T链接，获得转化了质粒的白色菌落；

步骤六，选取饱满的单菌落接种于培养液中培养过夜，并利用质粒提取试剂盒提取质粒，获得大量的质粒标准品，以用于菌液PCR鉴定和测序分析。

优选地，于步骤一中，下载pgmtc基因序列进行同源性比较分析，设计和合成特异性的引物，所述PCR产物长度为223bp，引物序列如下：上游引物为SEQ IDNO.2，下游引物为SEQ IDNO.3。

优选地，于步骤三中，采用反应体系为50μL，引物信息为：上游引物为SEQ IDNO.2，下游引物为SEQ IDNO.2，反应程序为：95℃预变性5分钟，随后95℃15秒，退火温度60℃45秒和72℃延伸40秒，进行45个循环，最终72℃延伸10分钟，并通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。

为达到上述目的，本发明还提供一种检测产2-甲基异莰醇菌株的方法，包括如下步骤：

步骤一，以重组质粒为标准品模板，用实时定量PCR进行PCR扩增，建立标准品的浓度与临界循环数对应的标准曲线；