[发明专利]一种金鱼Tgf2转座酶及其制备与保存方法

说明书

本发明公开一种金鱼Tgf2转座酶的制备方法，根据大肠杆菌对密码子的偏爱性和简并性把金鱼Tgf2转座酶中83个稀有密码子进行同义替换，进行重组表达与纯化。所获得的密码子优化的金鱼Tgf2转座酶发酵条件变得温和，而且酶活性也得到了提高，可溶性的活性金鱼Tgf2转座酶蛋白生产为鱼类转基因提供了一种选择性的工具。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及具体地说，是一种表达条件温和及高活性的金鱼Tgf2转座酶的制备方法与保存方法。

背景技术

转座子是一类可以在基因组中发生位置移动的一段DNA序列，被称为“跳跃因子”，转座子的应用在鱼类遗传育种、转基因、生物基因组的基因修饰等方面发挥着重要的作用。目前，国内外已经开展了大量关于DNA转座子的研究，结果表明具有自主转座活性的转座子所编码的转座酶不仅能够提高转座效率而且可以促进养殖鱼类的转基因以及启动子捕获研究。Tol2和Tgf2被称为DNA转座子中的“双鱼座”，其中Tol2是日本学者Koga等在白化的青鳉中发现的第一类具有自主转座活性的转座子，金鱼Tgf2是继青鳉之后的第二类具有自主转座活性的脊椎动物转座子，它们均属于hAT(hobo-AC-Tam3)超家族转座子，金鱼Tgf2转座酶是金鱼Tgf2转座子所编码的活性转座酶。但有关金鱼Tgf2密码子优化表达及其保存方法的研究还未见报道。

金鱼Tgf2转座酶(Tgf2-TPase)编码区全长2061bp，其序列包括4个开放阅读框(OFR)，同时具有中间反向重复序列和末端反向重复序列等与转座相关的结构域。已经证明，用Tgf2-TPase蛋白来代替Tgf2-TPase mRNA，与供体质粒共同直接注射到胚胎中有助于提高养殖鱼类中的插入效率。之前的研究表明在大肠杆菌Rosetta 1(DE3)菌株中生产重组Tgf2-TPase蛋白需要低温(22℃)、生长早期(OD₆₀₀＝0.3-0.4)的这种严苛的发酵条件。菌种在生长早期易染杂菌，不利于大量发酵。本发明中，将重组蛋白的发酵温度提高到了30℃，OD₆₀₀提高到了0.5-0.6，使其发酵条件变得温和，同时不易染杂菌。

发明内容

Tgf2-TPase中存在一些稀有密码子，必要地优化表达不仅可以提高生产条件，而且有可能还会增加Tgf2-TPase活性。

本发明涉及一种表达条件温和及高活性的金鱼Tgf2转座酶的制备及保存方法，根据大肠杆菌对密码子的简并性和偏好性对Tgf2-TPase中83个稀有密码子进行同义替换，并命名为Tgf2-TPase⁸³，在BL21(DE3)中进行表达。经过HisTrap^TMHP亲和柱纯化后用MALDI-(TOF)/TOF串联质谱进行鉴定。比较分析了-80℃下冻干酶粉、20％甘油、8％蔗糖和4％甘露醇四种不同保存方法的DNase酶活性，并用体积排阻色谱法鉴定了Tgf2-TPase⁸³DNA结合活性及其特异性。结果显示：(1)在相同的原核表达系统中，可溶性的重组Tgf2-TPase⁸³在30℃，OD₆₀₀＝0.5–0.6，1mM的IPTG诱导6h时可大量表达；(2)经过亲和层析纯化后，与Tgf2-TPase比较，优化的Tgf2-TPase⁸³有较高的酶活性；(3)对比四种不同的保存方法发现，将Tgf2-TPase⁸³保存在终浓度为20％的甘油中有助于保持其DNase消化活性；(4)体积排阻色谱结果表明纯化的Tgf2-TPase⁸³能够识别并特异性地结合含有Tgf2转座子末端反向重复(TIR)和亚末端重复(STR)序列的DNA探针。通过优化Tgf2转座酶中的83个密码子不仅使其发酵条件变得温和，而且酶活性也得到了提高，可溶性的活性Tgf2-TPase⁸³蛋白生产为鱼类转基因提供了一种选择性的工具。

本发明的第一个目的是针对稀有密码子难以表达的不足，提供一种发酵条件温和的表达方法。