[发明专利]一种基于TDR基因的转基因水稻不育系的培育方法在审
| 申请号： | 201810729442.8 | 申请日： | 2018-07-04 |
| 公开（公告）号： | CN108949814A | 公开（公告）日： | 2018-12-07 |
| 发明（设计）人： | 刘佳音;米铁柱;张国栋;罗碧;修旺珊;万吉丽 | 申请（专利权）人： | 青岛袁策集团有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46 |
| 代理公司： | 北京华仁联合知识产权代理有限公司 11588 | 代理人： | 李冰 |
| 地址： | 266000 山东省青岛市李*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因表达元件 不育系 转基因水稻 杂合体 扩增 基因 花粉特异性启动子 基因表达盒 水稻 分离定律 连锁基因 小麦花粉 致死基因 自交结实 引入 育性 培育 后代 申请 | ||
1.一种基于TDR基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、TagRFP基因表达盒的获得；
B、小麦花粉致死基因Ki的扩增；
C、水稻TDR盒的获得；
D、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增；
E、各基因表达元件的连接。
2.根据权利要求1所述一种基于TDR基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于：所述步骤C、水稻TDR盒的获得，进一步包括：
提取水稻植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以F2/R2为上下游引物进行完整TDR基因表达盒的扩增，扩增过程中分别在上游引物和下游引物中引入Sma I和Nael酶切位点，同时在Nael后方添加DraI酶切位点，其扩增的水稻TDR基因包含其上游的启动子和下游的终止子，同时包含所有的外显子和内含子。
3.根据权利要求1所述一种基于TDR基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于：所述步骤A、TagRFP基因表达盒的获得，进一步包括：
以含有TagRFP基因完整表达盒的质粒为模板，以F1/R1为上下游引物进行扩增，扩增过程中分别在上下游引物中引入AauI和Kpn I位点。
4.根据权利要求1所述一种基于TDR基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于：所述步骤B、小麦花粉致死基因Ki的扩增，进一步包括：
以水稻基因组DNA为模板，以F3/R3为上下游引物进行小麦花粉致死基因Ki的扩增，在上下游引物中引入DraI酶切位点；其扩增的致死基因Ki包含所有的外显子和内含子。
5.根据权利要求1所述一种基于TDR基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于：所述步骤D、花粉特异性启动子Pg47的扩增，进一步包括：
以水稻基因组DNA为模板，以F4/R4为上下游引物进行花粉特异性启动Pg47扩增，在上下游引物中分别引入Kpn I和Sma I酶切位点。
6.根据权利要求1所述一种基于TDR基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于：所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：
第一步，将TagRFP基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上；
第二步，将完整的水稻TDR基因引入第一步中已经引入TagRFP基因表达元件的pCAMBIA1390载体上；
第三步，将小麦花粉致死基因Ki连入到已经连有TagRFP基因表达元件和水稻TDR基因的pCAMBIA1390双元载体上；
第四步，将小麦花粉特异性启动Pg47连接到前三步已经连接上TagRFP基因表达元件、水稻TDR基因和小麦花粉致死基因Ki的复合载体上。
7.一种基于TDR基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于，应用水稻TDR基因表达盒构建如权利要求1～6中任一项所述方法制备的水稻不育系。
8.一种如权利要求1～6中任一项所述方法在水稻遗传育种中的应用。
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