[发明专利]一种基于TDR基因的转基因水稻不育系的培育方法

说明书

本申请公开了一种基于TDR基因的转基因水稻不育系的培育方法，包括以下步骤：A、TagRFP基因表达盒的获得；B、小麦花粉致死基因Ki的扩增；C、水稻TDR盒的获得：D、花粉特异性启动子Pg47的扩增；E、各基因表达元件的连接。所述步骤E、各基因表达元件的连接，进一步包括：第一步，将TagRFP基因表达元件连接到pCAMBIA1390载体上；第二步，将完整的水稻TDR基因引入第一步中已经引入TagRFP基因表达元件的pCAMBIA1390载体上。本发明F1代杂合体在自交结实过程中遵循孟德尔分离定律，产生的后代既有能保持三连锁基因的杂合体，又有无育性的不育系。

技术领域

本发明涉及分子生物学核酸化学技术领域，特别涉及一种水稻遗传工程不育系的制备方法。

背景技术

水稻是是世界上近一半的人口的主食，除可食用外，还可以酿酒、制糖和作为工业原料，人类对水稻的需求很大。多年来的生产实践表明，杂交水稻一般可比常规稻增产20％以上，因此杂交水稻彰显着巨大的增产潜力。

杂交水稻的发展依赖于杂交水稻不育系的培育。我国杂交水稻的研究始于上个世纪60年代，70年代开始大规模被种植。第一代杂交水稻是以核质互作雄性不育系为遗传工具的三系法，第二代杂交水稻是以光温敏雄性不育系为遗传工具的两系法，“三系法”和“两系法”杂交育种技术对粮食增产贡献巨大，但也存在问题。三系法中可利用的具有优良形状的父母本有限，配组不自由，野败保持系频率较低。

生产上现有的不育系间遗传差异小，杂交种育性稳定性不够，抵御逆境能力较差。而“两系法”中光温敏雄性不育系的育性受外界温度控制，易导致光温敏不育系自交结实，制种失败。因此开发新一代不育系对杂交水稻的发展至关重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供了一种基于TDR基因的转基因水稻不育系的培育方法。本发明将水稻普通核不育基因TDR与小麦花粉致死基因Ki连锁，同时以橙色荧光蛋白TagRFP基因作为报告基因，对水稻TDR突变体进行基因改造，获得F1代杂合体。F1代杂合体在自交结实过程中遵循孟德尔分离定律，产生的后代既有能保持三连锁基因的杂合体，又有无育性的不育系。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于TDR基因的转基因水稻不育系的培育方法，包括以下步骤：

A、TagRFP基因表达盒的获得；

B、小麦花粉致死基因Ki的扩增；

C、水稻TDR盒的获得；

D、花粉特异性启动子Pg47的扩增；

E、各基因表达元件的连接。

所述步骤C、水稻TDR盒的获得，进一步的包括：

提取水稻植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以F2/R2为上下游引物进行完整TDR基因表达盒的扩增，扩增过程中分别在上游引物和下游引物中引入Sma I和Nael酶切位点，同时在Nael后方添加DraI酶切位点，其扩增的水稻TDR基因包含其上游的启动子和下游的终止子，同时包含所有的外显子和内含子。

所述步骤A、TagRFP基因表达盒的获得，进一步包括：

以含有TagRFP基因完整表达盒的质粒为模板，以F1/RI为上下游引物进行扩增，扩增过程中分别在上下游引物中引入AauI和Kpn I位点。

所述步骤B、小麦花粉致死基因Ki的扩增，进一步包括：

以水稻基因组DNA为模板，以F3/R3为上下游引物进行小麦花粉致死基因Ki的扩增，在上下游引物中引入DraI酶切位点；其扩增的致死基因Ki包含所有的外显子和内含子。

所述步骤D、花粉特异性启动子Pg47的扩增，进一步包括：