[发明专利]血清内源性小分子在评价喉癌肿瘤细胞分化程度中的应用

权利要求书

1.血清内源性小分子在评价喉癌肿瘤细胞分化程度中的应用，其特征是：所述的血清内源性小分子指的是八个喉癌生物代谢标志物，它们是在喉鳞癌血清样本的基础上经过LC-MS代谢组学分析筛选出来的，具体包括代谢物L-Carnitine、代谢物9-Decenoylcarnitine、代谢物Glycocholic acid、代谢物Oleoyl glycine、代谢物cis-5-Tetradecenoylcarnitine、代谢物3,5-Tetradecadiencarnitine、代谢物2-Hydroxyadipicacid和代谢物Sphingosine 1-phosphate，依据八种血清内源性小分子含量变化对喉癌细胞的分化程度进行评价。

2.根据权利要求1所述的血清内源性小分子在评价喉癌肿瘤细胞分化程度中的应用，其特征是：所述的喉癌生物代谢标志物的筛选方法包括以下步骤：

(1)样本处理和分析：将血清样本于冰水混合物中解冻后，取100μL并加入400μL乙腈，充分震荡均匀后，4℃下13000rpm离心20min，取上清吹干，再加入100μL乙腈-水溶液后，涡旋2min，4℃下13000rpm离心20min，取上清液进行LC-MS分析，其中乙腈-水溶液中乙腈和水的体积比为4:1；

所述LC-MS分析中液相条件为：流动相A，含体积百分数为0.1％甲酸的水；流动相B，含体积百分数为0.1％甲酸的乙腈，梯度洗脱：0-2min，2％B；2-13min，2％B-35％B；13-28min，35％B-98％B；28-30min，98％B；30-32min，98％B-2％B；32-34min，2％B，进样量：3μL；流速，0.2mL/min；柱温:45℃；Waters ACQUITYUPLC HSST3色谱柱2.1mm×100mm，1.8μm；质谱条件为：采用HESI离子化方式，喷雾电压：正极，3.5kV；负极，2.5kV，毛细管温度320℃；加热器温度300℃；鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb；扫描模式为Full Scan/dd-MS2，采集范围为m/z 100-1500，正负离子切换采集模式；分辨率采用MS Full Scan 35000FWHM，MS/MS17500FWHM，NCE为12.5eV，25eV和37.5eV；

(2)数据处理：将LC-MS分析采集到的液相和质谱数据导入SIEVE软件包，完成谱峰识别、滤噪的前处理，前处理参数设置如下：时间范围：0-32min；质量范围：150-1500Da；质量偏差：0.01；最小强度：1％；质量窗：0.02；保留时间窗口：0.02；消除噪音水平：10；变化峰强度阈值：300，最后输出保留时间、精确质荷比和峰面积组成的三维矩阵，为消除样本之间的差异以及仪器所造成的误差，将上述所得到的数据导入Excel中进行峰面积归一化；

(3)模式判别分析：将Excel峰面积归一化后的数据导入SIMCA-P软件中，建立PLS-DA模型，为考察模型有效性，并对PLS-DA模型进行预测，采用200次排列实验对PLS-DA模型进行验证，模型成立的基础上，采用OPLS-DA去除与实验观察无关的随机信息，从而最大化提取与实验有关的变化来寻找两组之间的差异代谢物；

(4)差异代谢物筛选：以p<0.05,VIP>1和|p(coor)|>0.5为标准筛选得到差异代谢物八个，即八个喉癌生物代谢标志物及其每个代谢物在喉癌细胞处于中分化状态时的归一化均值面积，代谢物L-Carnitine、代谢物9-Decenoylcarnitine、代谢物Glycocholic acid、代谢物Oleoyl glycine、代谢物cis-5-Tetradecenoylcarnitine、代谢物3,5-Tetradecadiencarnitine、代谢物2-Hydroxyadipic acid和代谢物Sphingosine 1-phosphate，其中p值代表统计学差异，VIP值代表筛选变量的重要性，|p(coor)|值代表筛选变量与实验有关的变化的相关性)；

(5)根据步骤(4)得出八个血清代谢标志物在喉癌细胞处于中分化状态时的归一化均值面积，分别判断喉癌细胞的分化状态：当喉癌血清样本中代谢物L-Carnitine、Glycocholic acid、Sphingosine 1-phosphat的归一化均值面积分别低于中分化状态时的归一化均值面积，且p<0.05；喉癌血清样本中代谢物9-Decenoylcarnitine、Oleoylglycine、cis-5-Tetradecenoylcarnitine、3,5-Tetradecadiencarnitine、2-Hydroxyadipic acid的归一化均值面积分别高于中分化状态时的归一化均值面积，且p<0.05；时，则说明喉癌肿瘤细胞处于高分化状态；当喉癌血清样本中代谢物L-Carnitine、Glycocholic acid、Sphingosine 1-phosphat的归一化均值面积分别高于中分化状态时的归一化均值面积，且p<0.05；喉癌血清样本中代谢物9-Decenoylcarnitine、Oleoylglycine、cis-5-Tetradecenoylcarnitine、3,5-Tetradecadiencarnitine、2-Hydroxyadipic acid的归一化均值面积分别低于中分化状态时的归一化均值面积，且p<0.05；时，则说明喉癌肿瘤细胞处于低分化状态。

3.根据权利要求2所述的血清内源性小分子在评价喉癌肿瘤细胞分化程度中的应用，其特征是所述的步骤(4)中每个代谢物在喉癌细胞处于中分化状态时的归一化均值面积分别为：

代谢物L-Carnitine：在喉癌细胞处于中分化状态时的归一化均值面积为0.000433±0.000231；

代谢物9-Decenoylcarnitine在喉癌细胞处于中分化状态时的归一化均值面积为0.000221±0.000105；

代谢物Glycocholic acid在喉癌细胞处于中分化状态时的归一化均值面积为9.45E-06±9.31E-06；

代谢物Oleoyl glycine在喉癌细胞处于中分化状态时的归一化均值面积为9.17E-05±3.14E-05；

代谢物cis-5-Tetradecenoylcarnitine在喉癌细胞处于中分化状态时的归一化均值面积为7.29E-05±4.01E-05；

代谢物3,5-Tetradecadiencarnitine在喉癌细胞处于中分化状态时的归一化均值面积为5.35E-05±3.23E-05；

代谢物2-Hydroxyadipic acid在喉癌细胞处于中分化状态时的归一化均值面积为0.00011±3.3E-05；

代谢物Sphingosine 1-phosphat在喉癌细胞处于中分化状态时的归一化均值面积为0.000108±1.29E-05。