[发明专利]一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌

说明书

本发明公开了一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，属于基因工程技术领域。本发明工程菌实现了放线菌来源的内源性磷脂酶D在枯草芽孢杆菌中的高效表达，其生产得到的磷脂酶D活性可达25U/mL，在医药、食品、保健品领域具有很大的应用价值；同时，其采用的磷脂酶D是放线菌来源的内源性磷脂酶D，具有高反应活性、高转磷脂酰底物选择性以及高有机介质稳定性，且催化结构最紧密，更适用于工业化生产中磷脂以及磷脂衍生物的高效合成。

技术领域

本发明涉及一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，属于基因工程技术领域。

背景技术

磷脂酶D属于磷脂酰二酯合成酶类，具有该家族的明显特征，即含有两个间隔出现的H(x)K(x)4D(H代表组氨酸；K代表赖氨酸；D代表天冬氨酸；X代表任意氨基酸)保守序列。它可以催化底物相中的磷脂类物质和水相中的亲核供体发生类似于酯缩合的转酯反应，是合成磷酯酰丝氨酸，磷脂酰肌醇等稀有磷脂的良好工具酶一。

利用磷脂酶D具有高度专一性的特点，对现有来源广泛的粗品磷脂进行转化和改性，可以制备一些稀有磷脂，在医药及食品保健品领域具有很大的应用价值。

目前，磷脂酶D主要通过从大豆等植物或动物脑中分离提取得到，生产成本高，环境污染代价大，售价昂贵，不能满足市场需求；现有的一些通过生物发酵大量获得真核来源的尝试，结果都不理想，这些真核在发酵生产时，要么生成的酶活性低，要么生成的酶呈现与膜结合的状态。因此，急需找到一种可大量制备磷脂酶D的方法。

放线菌来源的内源性磷脂酶D和植物以及真菌来源的磷脂酶D相比，除具有较高的反应活性外，更兼具转磷脂酰底物选择性高，催化结构最紧密以及在有机介质稳定性高等方面的优势，更适合应用于工业中磷脂以及磷脂衍生物的高效合成。

目前，该来源的磷脂酶D在大肠杆菌，毕赤酵母，解脂耶氏酵母，链霉菌中表达均有报道。有研究表明在大肠杆菌中磷脂酶D蛋白易形成包涵体，且磷脂酶D对大肠杆菌的生长有抑制作用，导致分泌量很低；而酵母为真核生物，发酵周期通常较长，且在酵母中磷脂酶D的酶活和蛋白表达量均不显著，并不适用于工业化生产；虽然链霉菌的克隆表达系统已经比较成熟，但相比于原核表达系统，外源基因的引入相对复杂，部分链霉菌还存在一定的限制修饰系统，导致转化率过低，且链霉菌生长过程较为复杂且易发生遗传突变，成熟的表达系统数量也有限，以上瓶颈限制了链霉菌表达系统的广泛应用。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别，且具有清晰的生理和遗传背景，我们尝试以枯草芽孢杆菌为表达宿主来表达磷脂酶D并运用基因工程手段构建一种适用于工业生产的能大量生产磷脂酶D的重组枯草芽孢杆菌。

但是，链霉菌属于放线菌目的一科，枯草芽孢杆菌则属于芽孢杆菌属的一种，两者属于不同的菌种，遗传上可能存在一些隔阂，导致链霉菌来源的目的基因可能并不能被枯草所识别。

因此，在枯草芽孢杆菌中表达磷脂酶D存在一定的难点；如何基因工程手段提高磷脂酶D的表达量也仍需进一步的研究。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种高效表达磷脂酶D的枯草芽孢杆菌工程菌，实现了放线菌来源的内源性磷脂酶D在枯草芽孢杆菌中的高效表达。本发明工程菌生产得到的磷脂酶D活性可达25U/mL，在医药、食品、保健品领域具有很大的应用价值；同时，本发明工程菌采用的磷脂酶D是放线菌来源的内源性磷脂酶D，其具有高反应活性、高转磷脂酰底物选择性以及高有机介质稳定性，且催化结构最紧密，更适用于工业化生产中磷脂以及磷脂衍生物的高效合成。

本发明的技术方案如下：