[发明专利]一种检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法

权利要求书

1.一种检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)根据已公布的西瓜基因组序列信息设计SSR引物，在所设计出的SSR引物中筛选出在‘丰华21’父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物，所筛选出来的SSR引物如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

(2)利用步骤(1)最终筛选出来的SSR引物制备‘丰华21’SSR指纹图谱；

(3)对待检测的西瓜种子进行播种，CTAB法提取子叶期叶片的基因组DNA，利用步骤(1)中最终筛选出的SSR引物进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得待检测种子的SSR扩增带型，通过与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对，如比对结果一致，则可以判定为真实的‘丰华21’西瓜杂交种。

2.根据权利要求1所述的检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法，其特征在于，所述步骤(3)中还包括种子纯度的计算，将待测西瓜种子与步骤(2)制备出的‘丰华21’SSR指纹图谱进行比对后，采用如下公式计算得到种子纯度，

种子纯度＝(检测所得真种子数/检测种子总数)×100％……公式(一)。

3.根据权利要求1所述的检测‘丰华21’西瓜种子真实性和纯度的方法，其特征在于，所述步骤(1)中筛选出在父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物的方法为：

a、‘丰华21’西瓜杂交种及父、母本叶片基因组DNA提取：

①在2.0ml离心管中加入玻璃珠，取100mg子叶期的西瓜叶片置于离心管中，在打样机上磨碎；

②向离心管中加入800μL 65℃预热的2％CTAB裂解液，充分混匀，65℃水浴1h；

③加入800μL的氯仿抽提液，所述氯仿抽提液由氯仿、异戊醇按照体积比为24：1混合组成，轻轻混匀5min，然后在12000r·min-1离心5min；

④吸取500μL上清液，转移至新的2.0mL离心管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇，然后将离心管置于4℃冰箱中，至DNA沉淀析出；

⑤弃上清，用75％乙醇清洗DNA，弃上清后于室温晾干；

⑥向每个离心管中加入包含1μL RNase的100μL ddH2O，用涡旋仪振荡溶解DNA，37℃水浴1h，消化其中残存的RNA；

⑦用核酸仪测量DNA的浓度和质量，将DNA稀释至50ng·μL-1，置于-20℃冰箱保存备用；

b、‘丰华21’及父、母本PCR扩增：

利用步骤(1)中设计出的SSR引物对‘丰华21’杂交种及其父、母本的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系15μL：2μL质量浓度为50ng·μL-1DNA，质量浓度10ng·μL-1正向、反向引物各0.4μL，浓度为2.5U·μL-1的Taq酶0.2uL，dNTP 0.2μL，10×Taq buffer 1.5μL，ddH 2O10.3μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃保温8min；

c、将PCR反应产物使用体积浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，筛选出在‘丰华21’父、母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物：

①装板：长板在下，其凹面与短板相对，底端齐平，两侧用夹子夹好，水平放置；

②灌胶：将配好的体积浓度为8％的聚丙烯酰胺胶50mL匀速倒入夹好的长短板之间，胶板体积338mm×96mm×1mm，同时将梳子轻轻插上，凝胶1h；

③上板：将②中玻璃板装入垂直式电源槽，并倒入400ml 0.5×TBE作为缓冲液，后将梳子拔出；

④点样：在15μLPCR反应体系中加入2μL溴酚蓝，点样量为4.5μL；

⑤电泳：电压恒定，160V，电泳时间为1.5h；

⑥银染显色：电泳结束后，卸槽，将长短板分离，进行银染显色，其过程及溶液配方如下：

固定：将脱离玻璃板的胶片放入500mL固定液中，所述固定液包括50mL无水乙醇、2.5mL冰醋酸、347.5mL蒸馏水，在摇床上轻摇10min，将固定液回收；

银染：将固定好的胶片浸入500mL银染液中，所述银染液包括500mL蒸馏水、1g硝酸银，均匀摇动，12min后将银染液倒掉；

水洗：加入500mL蒸馏水，25s后将水倒掉；

显色：将漂洗过的胶片转移至500mL显色液中，所述显色液包括500mL蒸馏水、7.5gNaOH、1.5mL甲醛，显色7min后将显色液倒掉；

再次固定：将显色后的胶片放进中回收的固定液中，摇床上轻摇1min，将胶片取出，放在平展的保鲜膜上，包好保存，于胶片观察灯下进行带型统计分析；

⑦对在‘丰华21’杂交种及其父、母本中呈现多态性的SSR引物进行记录和再次筛选确认，最终获得在父母本和杂交种中呈现多态性且稳定的SSR引物。