[发明专利]A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用

权利要求书

1.一种A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）设计扩增ALV-A/B gp85基因的特异性引物；

（2）PCR扩增获得gp85基因片段并纯化；

（3）将ALV-A/B 的gp85基因分别克隆至pET-32a原核表达载体，筛选阳性克隆后测序鉴定；

（4）重组表达载体pET-32a-A/B-gp85的表达；

（5）尿素法纯化表达的gp85蛋白；

（6）重组gp85蛋白的复性。

2. 根据权利要求1所述的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，

ALV-A/B-F：5’- CGGGATCC GCTGATGTTCACTTACTCG -3’

ALV-A/B-R：5’- CCCAAGCTTTTA TCGTTTATGTCTTACCCCTG -3’ 。

3. 根据权利要求1所述的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，其特征在于，步骤（3）中，gp85基因片段及pET-32a空载体分别用BamHⅠ、HindⅢ快速内切酶进行双酶切，37 ℃温浴15 min，纯化双酶切后的目的基因和载体片段，配置10 μL连接体系，4 ℃反应过夜；连接产物转化E.coli Rosetta (DE3)感受态，涂氨苄青霉素LB平板后，37 ℃温箱孵育过夜；挑取LB平板上单个的白色菌落，接种于5 mL含Amp的LB液体培养基中，37 ℃培养10 h，提取质粒。

4. 根据权利要求1所述的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，其特征在于，步骤（4）中，表达条件为：37 ℃，摇床转速为160 rpm，终浓度为0.1 mM的IPTG，诱导5 h。

5. 根据权利要求1所述的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，其特征在于， 步骤（5）中，用溶液1重悬菌体，超声波冰浴裂解，再依次通过溶液2、溶液3、溶液4洗涤，溶液5溶解包涵体，装入处理过的透析袋中，以TE buffer溶解的4M尿素溶液为初始透析液，通过逐渐稀释透析液的方法使透析袋中的尿素浓度依次降低，至袋中尿素浓度为零时收获复性蛋白；

溶液1：50 mmol/L Tris-Hcl，pH=8.0，1 mmol/L EDTA，pH=8.0，100 mmol/L NaCl；

溶液2：500 mmol/L Tris-Cl，pH=8.0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5 %TritonX-100；

溶液3：溶液2含2 M尿素；

溶液4：溶液2含4 M尿素；

溶液5：溶液2含8 M尿素。