[发明专利]A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用

说明书

本发明公开了一种A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用，包括下列步骤：（1）设计并合成扩增gp85基因的特异性引物；（2）PCR扩增获得gp85基因片段并纯化；将ALV‑A/B的gp85基因分别克隆至pET‑32a原核表达载体，筛选阳性克隆后测序鉴定；（4）重组表达载体pET‑32a‑A/B‑gp85的表达；（5）尿素法纯化表达的gp85蛋白；（6）重组gp85蛋白的复性。利用本发明的方法获得了高纯度的可溶性gp85蛋白。表达的蛋白可作为包被抗原建立抗体检测方法，还可用于免疫动物制备抗血清，为免疫荧光、免疫组化等提供原材料。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用。

背景技术

禽白血病（AL）是由禽白血病病毒（ALV）肉瘤病毒群病毒引起的禽类多种良性和恶性肿瘤性疾病，临床上多以免疫抑制、生长抑制和多器官组织出现肿瘤等为主要特征。根据宿主范围、囊膜蛋白抗原性和交叉中和反应等，将其分为Ａ-Ｋ共11个亚群，其中Ａ-Ｄ、Ｊ和Ｋ亚群为外源性ALV。Ｃ、Ｄ 亚群在野外很少见，Ｅ-I亚群为内源性ALV，而Ｆ-Ｉ亚群主要感染野生禽类。外源性ALV中，A、B和J亚群对鸡有明显的致病性，对养禽业生产的危害也较大。由于我国地域广阔、养殖环境复杂、病毒不断变异，给ALV的净化带来了极大的困难。

近几年在我国鸡群、尤其地方品系中又分离到了ALV-A、ALV-B。当前有针对ALV-A/B 的ELISA抗体检测试剂盒，但只用于检测鸡群中ALV-A/B的抗体水平，并不能判断鸡群中现在是否还有ALV-A/B的感染。我国开展血清学监测通常使用美国等公司的ELISA检测试剂盒，检测成本高、推广范围窄。根据国外毒株研制的检测方法和试剂盒不能够准确的检测到国内鸡群的感染状况，因此建立适用的ALV-A/B检测体系对ALV净化显的尤为重要。

ALV-A/B囊膜糖蛋白中的表面蛋白gp85含有许多抗原表位，是制备区分病毒亚群的特异性抗体的首选蛋白。如何应用ALV-A/B分离毒株的重组gp85蛋白进行原核表达并纯化得到纯度高可溶性好的gp85蛋白，是本发明要解决的技术问题。

发明内容

本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法，应用ALV-A/B分离毒株的重组gp85蛋白进行原核表达并利用尿素法纯化得到的包涵体蛋白，通过透析复性得到了纯度高可溶性好的gp85蛋白。表达的蛋白可作为包被抗原建立抗体检测方法，还可用于免疫动物制备抗血清，为免疫荧光、免疫组化等提供原材料。同时，利用单克隆抗体技术制备抗蛋白的单克隆抗体，为今后对该病毒的临床诊断和抗原检测试剂盒的开发提供物质基础。

本发明的A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白技术方案为，

一种A或B亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白纯化方法，包括以下步骤：

（1）设计扩增ALV-A/B gp85基因的特异性引物；

（2）PCR扩增获得gp85基因片段并纯化；

（3）将ALV-A/B 的gp85基因分别克隆至pET-32a原核表达载体，筛选阳性克隆后测序鉴定；

（4）重组表达载体pET-32a-A/B-gp85的表达；

（5）尿素法纯化表达的gp85蛋白；

（6）重组gp85蛋白的复性。

步骤（1）中，

ALV-A/B-F：5’-CGGGATCC GCTGATGTTCACTTACTCG-3’（加粗代表保护碱基，斜体为BamHⅠ酶切位点）