[发明专利]一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻保护剂及冷冻方法

权利要求书

1.一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻方法，利用冷冻保护剂进行多级冷冻，具体步骤为：

步骤1：向含卵粒的海水中加入甘油和一半的乙二醇，搅拌混匀，然后在25-45min内将混合液的温度匀速降温至2-5°C，备用；

步骤2：向步骤1得混合液中加入剩余的乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖，搅拌混匀，然后在85-120min内匀速降温至-85至-75°C，备用；

步骤3：将步骤2得混合液在120-160min内匀速降温至-200至-190°C，然后转移至液氮中保存；

所述冷冻保护剂包括如下成分及其重量份：含卵粒的海水80-110份、乙二醇1.2-3.8份、甘油2.1-4.3份、二甲基亚砜0.6-1.2份、海藻糖1.2-2.5份，所述海藻糖中含有0.21-0.25%的L-(-)-海藻糖；所述含卵粒的海水中卵粒的密度为950-1100粒/mL，所述海水为经过预处理的天然海水，其盐度为2.7-3.5%；所述海水的预处理步骤为：将天然海水用滤膜通过真空过滤泵筛去浮沙与杂物，灭菌后加入含有D-半胱氨酸的半胱氨酸和抗坏血酸钠，并且期间连续充气24-36h，最后调节海水的盐度，即可；所述半胱氨酸中含有0.4-0.7%的D-半胱氨酸；所述半胱氨酸和抗坏血酸钠的添加量分别为0.25-0.33mg/L和0.07-0.15mg/L。

2.根据权利要求1所述的冷冻方法，其特征在于：所述冷冻方法的具体步骤为：

步骤1：向含卵粒的海水中加入甘油和一半的乙二醇，搅拌混匀，然后在30min内将混合液的温度匀速降温至4°C，备用；

步骤2：向步骤1得混合液中加入剩余的乙二醇、二甲基亚砜和海藻糖，搅拌混匀，然后在100min内匀速降温至-80°C，备用；

步骤3：将步骤2得混合液在150min内匀速降温至-196°C，然后转移至液氮中保存；

所述冷冻保护剂包括如下成分及其重量份：含卵粒的海水100份、乙二醇3份、甘油3份、二甲基亚砜1份、海藻糖2份，所述海藻糖中含有0.22%的L-(-)-海藻糖；所述含卵粒的海水中卵粒的密度为1000粒/mL，所述海水为经过预处理的天然海水，其盐度为3.0%；所述海水的预处理步骤为：将天然海水用滤膜通过真空过滤泵筛去浮沙与杂物，灭菌后加入含有D-半胱氨酸的半胱氨酸和抗坏血酸钠，并且期间连续充气30h，最后调节海水的盐度，即可；所述半胱氨酸中含有0.55%的D-半胱氨酸；所述半胱氨酸和抗坏血酸钠的添加量分别为0.29mg/L和0.11mg/L；

所述冷冻方法冻存1d、2d、4d和7d的卵粒孵化率依次为59.4%、58.7%、54.6%和53.9%。