[发明专利]一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻保护剂及冷冻方法

说明书

本发明公开了一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻保护剂及冷冻方法。该冷冻保护剂包含含有L‑(‑)‑海藻糖的海藻糖和含卵粒的海水，主要包括如下成分及其重量份：含卵粒的海水80‑110份、乙二醇1.2‑3.8份、甘油2.1‑4.3份、二甲基亚砜0.6‑1.2份、海藻糖1.2‑2.5份。本发明冷冻方法为利用上述冷冻保护剂进行多级冷冻。有益效果为：本发明冷冻保护剂能够发挥增益作用，能有效抑制卵粒细胞内冰晶的形成，减弱冰晶对卵粒的损伤程度，提高桡足类卵粒的孵化率，改善冻融后卵粒的发育潜能；本发明冷冻方法能配合冷冻保护剂的施用，有效控制卵粒的渗透压变化，避免胞内冰冰的形成，降低了桡足类卵粒的冰晶损伤。

技术领域

本发明涉及卵粒超温储存技术领域，尤其是涉及一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻保护剂及冷冻方法。

技术背景

在海洋生态系统中，浮游动物种群变化和生产力的高低，对于整个海洋生态系统结构、功能、以及生物资源的补充都具有十分重要的影响。海洋挠桡足类，隶属于节肢动物门（Arthropoda）、甲壳亚门（Crustacea）、桡足纲（Copepoda），为小型甲壳动物，体长3mm，营浮游、底栖或寄生生活，分布于海洋、淡水或半咸水中，数量极大，种类繁多，既是中、上层经济鱼类的主要摄食对象，又是养殖鱼、虾类幼体的重要开口饵料之一，故在水生态系统食物网和水产养殖中具有重要意义。挠足类的数量变动不仅与渔业的丰歉直接相关，对渔业资源结构有间接的影响，而且，对浮游植物的数量变化有着重要的调控作用，从而影响甚至改变海洋生态系统物流和能流路径和流向。此外，挠足类作为生产力第二环节次级生产力中的重要组成部分，在初级生产和更高营养级之间起着承上启下的重要作用，在海洋生态系统中占有非常重要的位置。由于挠足类在整个海洋生态系统中重要作用，被列入当今一些国际重大研究计划的重点研究内容。因此，实验室条件下对桡足类的养殖是实现对其生物学研究的基础，桡足类成熟卵粒的超低温冷冻是桡足类世代发育和受精卵冻存研究中的一项重要课题。

在超低温冷冻保存过程中，生物细胞会因受到不同类型的损伤（低温冷害、水和冷冻保护剂引起原生质膜内外的渗透压变化、冰晶形成所引起的机械性损伤、冷冻保护剂的化学毒性以及细胞对其的敏感度和耐受性等）而被损坏。目前常用的超低温冷冻方法主要是程序冷冻法和玻璃化冷冻法，前者主要是使用渗透较慢的低温保护剂，使冷冻保护剂充分渗透入细胞内平衡，借助于程序冷冻仪进行缓慢降温，最后再投入到液氮中进行长期保存。玻璃化冷冻法是将细胞使用适合的冷冻保护剂进行短暂处理后，直接投入到液氮中。然而，目前能够检索到的超低温冷冻方法在桡足类受精卵冻存应用上取得的效果（孵化率低下）均不理想。因此，亟待新的超低温冻存方法以解决以上问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种各成分能够发挥增益作用，能有效抑制卵粒细胞内冰晶的形成，减弱冰晶对卵粒的损伤程度，提高桡足类卵粒的孵化率，改善冻融后卵粒的发育潜能的用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻保护剂。

本发明的目的之一在于提供一种能配合冷冻保护剂的施用，有效控制卵粒的渗透压变化，避免胞内冰冰的形成，降低了桡足类卵粒的冰晶损伤的用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

一种用于桡足类卵粒超低温储存的冷冻保护剂，包含含有L-(-)-海藻糖的海藻糖和含卵粒的海水。L-(-)-海藻糖的存在能够在冷冻过程中促进海藻糖在卵粒的失水部位与蛋白质和膜脂质形成氢键，同时L-(-)-海藻糖中的羟基也能和膜磷脂中的磷酸根结合反应而将卵粒细胞周围内的水分置换释放胞外，加快了胞内水分的排出速率，降低了胞内冰晶形成的体积，从而减弱了冰晶对卵粒的损伤程度，此外，L-(-)-海藻糖还能和使用还能和乙二醇、甘油、二甲基亚砜发挥增益作用，大大降低溶液的凝固点，保证卵粒能够有充足的时间将细胞内水分适当性的渗出，避免胞内冰的形成，使冻融后卵子的功能得以保护，大大改善冻融后卵粒细胞的孵化率和发育潜能。

优选的，海藻糖中含有0.21-0.25%的L-(-)-海藻糖。