[发明专利]基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，其特征在于，该方法包括：

（1）获取特异识别大肠杆菌O157:H7的16S rDNA的转录激活因子样效应物核酸酶，所述转录激活因子样效应物核酸酶特异识别大肠杆菌O157:H7的16S rDNA中18bp长的一段序列，该序列一条链具有如下碱基序列：

5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’；

（2）获取“拟人”分子信标，所述“拟人”分子信标合成过程包括：将发夹、左臂、右臂、左腿、右腿、双蒸水充分混合，然后高温变性，逐渐降到室温；

发夹：5’-GATCAACTACTACTTGGTAAGGGTTTTTTTTTTTTTTTCC CTTTGTTTCTCTAATTAAGGC-3’；

其中，5’端第18位T碱基上和3’端第18位T碱基上分别连接有荧光基团和与其相应的猝灭基团；

左臂：

5’-TGGCGGACGGGTGAGTAATCCAAGTAGTAGTTGATC-3’；

右臂：5’-GCCTTAATTAGAGAAACTTTACTCACCCGTCCGCCA-3’；

左腿：5’-TTACTCACCCGTCCGCCA-3’；

右腿：5’-TGGCGGACGGGTGAGTAA-3’；

（3）对大肠杆菌O157:H7的16S rDNA进行RPA等温扩增，获得目标序列；所述等温扩增的引物为：

5’-GCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAG-3’，和

5’-CCCTCTTTGGTCTTGCGACGTTATGCGGTA-3’

（4）将目标序列、分子信标、转录激活因子样效应物核酸酶混合，震荡反应；测定震荡反应产物的荧光值；

（5）按照上述方法检测一系列不同浓度的大肠杆菌O157:H7，建立大肠杆菌O157:H7浓度与荧光值的标准曲线；

（6）按照上述方法检测未知浓度的含大肠杆菌O157:H7样品，测定荧光值，代入步骤（5）的标准曲线，计算出样品中大肠杆菌O157:H7的浓度。

2.根据权利要求1所述的基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，其中，所述高温变性的条件包括：在95℃保持2-5min。

3.根据权利要求1所述的基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，其中，所述发夹、左臂、右臂、左腿、右腿的浓度均为5-20 µM。

4.根据权利要求1所述的基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，其中，所述荧光基团为FAM；所述猝灭基团为BHQ-1。

5.根据权利要求1所述的基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌O157:H7检测方法，其中，一系列不同浓度的大肠杆菌O157:H7的浓度范围为3 cfu/mL~1×10⁷ cfu/mL。