[发明专利]用于定量检测人巨细胞病毒的微滴数字PCR试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于定量检测人巨细胞病毒的微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述微滴数字PCR试剂盒包括微滴数字PCR检测试剂，所述微滴数字PCR检测试剂中含有用于检测人巨细胞病毒核酸的引物和探针；所述用于检测人巨细胞病毒核酸的引物和探针包括由SEQ IDNO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团。

2.根据权利要求1所述的微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ。

3.根据权利要求1所述的微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述微滴数字PCR检测试剂中还含有数字PCR缓冲液。

4.根据权利要求3所述的微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述微滴数字PCR检测试剂中含有数字PCR缓冲液8～12μL、SEQ ID NO:1所示的正向引物0.01～0.015nmol、SEQ IDNO:2所示的反向引物0.01～0.015nmol、SEQ ID NO:3所示的探针0.002～0.006nmol；

优选的，微滴数字PCR检测试剂中含有数字PCR缓冲液10μL、SEQ ID NO:1所示的正向引物0.013nmol、SEQ ID NO:2所示的反向引物0.013nmol、SEQ ID NO:3所示的探针0.004nmol。

5.根据权利要求1所述的微滴数字PCR试剂盒，其特征在于，所述微滴数字PCR试剂盒中还包括微滴生成油、微滴生成卡、96孔板和铝箔热封膜。

6.一种利用权利要求1～5任一项所述的微滴数字PCR试剂盒定量检测人巨细胞病毒核酸的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

(1)提取待测样本DNA；

(2)配制微滴数字PCR反应混合液：将所述微滴数字PCR检测试剂和待测样本DNA模板混合，得到所述微滴数字PCR反应混合液；

(3)将所述数字PCR反应混合液和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成仪中生成微滴，然后进行PCR扩增反应；

(4)读取荧光信号：将扩增后的96孔板置于微滴读取仪中，利用软件直接进行结果读取和分析。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微滴数字PCR检测试剂和所述待测样本DNA模板的体积比为12～15：5～8；优选为13：7。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生成微滴的方法至少包括以下步骤：

(1)将微滴生成卡固定在卡托中，取8个所述微滴数字PCR反应混合液加入到微滴生成卡中间一排的8个孔内；

(2)在微滴生成卡最底下一排8个孔中加入微滴生成油，盖上胶垫；

(3)将卡托放置于微滴生成仪中，开始生成微滴；微滴生成于微滴生成卡最上面一排孔内，将生成的微滴转移至96孔板相应位置孔内；

(4)使用封膜仪进行封膜，封好膜之后在96孔PCR仪内进行PCR反应。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的条件为：首先在95℃条件下保温9～11min；然后94℃保温14～16秒、57℃保温58～62秒，共进行38～42个循环；最后在98℃条件下保温8～12min，降温至4℃保温5～6分钟；

优选为：首先在95℃条件下保温10min；然后94℃保温15秒、57℃保温60秒，共进行40个循环；最后在98℃条件下保温10min，降温至4℃保温5分钟；

更优选的，升降温的速度≤2℃/秒。

10.一种采用微滴数字PCR检测人巨细胞病毒核酸的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的序列包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团；

优选的，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ。