[发明专利]用于定量检测人巨细胞病毒的微滴数字PCR试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种用于定量检测人巨细胞病毒的微滴数字PCR试剂盒及检测方法。微滴数字PCR试剂盒包括微滴数字PCR检测试剂，微滴数字PCR检测试剂中含有用于检测人巨细胞病毒核酸的引物和探针；用于检测人巨细胞病毒核酸的引物和探针包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针；探针的两端标记有荧光基团。本发明的试剂盒具有快速精确、特异性好、灵敏度高、无需依赖标准品，可直接进行绝对定量。

技术领域

本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种用于定量检测人巨细胞病毒的微滴数字PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)属疱疹病毒科巨细胞病毒属，直径150-200nm，核心为双链、线形DNA结构，外包直径为100nm的20面体对称的衣壳，衣壳由162个壳粒组成，其中150个为六邻体，12个为五邻体，核衣壳外有一皮层包裹，病毒体最外层是一含有多种病毒编码糖蛋白的脂质双层包膜。病毒衣壳中有5种多肽，2种为主要结构蛋白，即衣壳主要蛋白质和次要蛋白质。衣壳主要蛋白质分子量为150kDa，免疫原性较低。人巨细胞病毒只有一个血清型，只感染人而不感染动物。人巨细胞病毒是人类疱疹病毒组中最大的一种病毒。这种病毒进入细胞内以后会导致细胞增大，引起人类巨细胞病毒感染。

人巨细胞病毒在人群中感染非常普遍，但大多数呈临床不显性感染，多数人在儿童或青少年期受HCMV感染获得免疫。在孕妇中，原发或新的HCMV感染均可引起新生儿宫内感染或围产期感染，可导致胎儿畸形，智力低下或发育迟缓等，严重者可引起全身性感染综合症，称为巨细胞包涵体病。近年来的研究发现，HCMV的感染特别是它所引起的母婴传播十分常见，已经成为损害儿童健康的重要原因。30％的人巨细胞病毒死亡是由于多器官损伤、严重肝功能不良、出血、并发细菌感染而引起，且大多发生在新生儿时期。而幸存者90％以上有明显的后遗症，如感觉神经性耳聋，智力低下，脉络膜视网膜炎与眼球萎缩及其他神经系统异常。

人巨细胞病毒感染又是一种机会感染，在免疫健全的人群中很少发生。随着免疫低下的人群(艾滋病、放射损伤、恶性肿瘤等患者)的日益增多，HCMV的感染及其引发的严重疾病有日益增加的趋势，这使人们对人巨细胞病毒分子生物学、流行病学、诊断技术、治疗和预防等研究更为重视。

传统的HCMV实验室检测方法主要包括病毒的分离与鉴定、病毒中和试验(VNT)、补体结合试验(CFT)、间接血凝试验(IHA)、琼脂免疫扩散试验(AGID)和液相阻断酶联免疫吸附试验(液相阻断ELISA)等。随着分子生物学技术的不断发展，开始通过分子生物学方法对HCMV进行检测，使得检测方法较之传统方法具有特异性更强、灵敏度更高、自动化程度更高和结果重复性更好等优势。目前常用的核酸检测方法主要为以聚合酶链反应(PCR)为基础的实时荧光RT-PCR试验(Real timeRT-PCR)。但这种检测方法需要建立标准曲线，而且病毒滴度通常处于较低的水平，影响了HCMV检测的准确性，仅能实现HCMV的定性和相对定量检测。同时RT-PCR方法在灵敏度和特异性上存在一定的局限性，对于病毒核酸提取过程中的某些化学物质较为敏感，进而抑制PCR反应，造成“假阳性”的结果。早期诊断和疫苗的有效使用对于HCMV的防控具有非常重要的意义。HCMV的早期诊断需要快速、准确的检测方法，而疫苗的研发和评价需要能够对HCMV进行准确的定量检测。因此，建立对HCMV快速、精确定量检测的方法，将为人巨细胞病毒快速有效控制提供坚实的技术支撑。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的发明目的在于提出一种用于定量检测人巨细胞病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法。

本发明的又一发明目的在于提出一种采用数字PCR检测人巨细胞病毒核酸的引物和探针。

为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：