[发明专利]一种永久标记细胞核的慢病毒表达载体及标记方法

说明书

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种永久标记细胞核的慢病毒表达载体及标记方法。采用慢病毒感染细胞，使用带有核定位信号序列的荧光蛋白标记细胞核，同时病毒载体上的另一发出不同荧光信号的荧光蛋白标记整个细胞。本发明的方法同时标记了细胞核及细胞，可以安全、永久、准确地观察细胞在体内体外的存活、有丝分裂过程、运动的情况。且该方法对细胞的生长无影响，具有良好的应用前景和发展空间。

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种永久标记细胞核的慢病毒表达载体及标记方法。

背景技术

在传统细胞核荧光标记技术中，大多使用有机荧光染料，如4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和碘化内啶(PI)，进行细胞核标记。DAPI和PI都可以和细胞核内的染色体DNA强力结合，从而可以用于细胞核定位、观察结构和形态的改变。

有机荧光染料有使用较方便的优点，但是同时存在着荧光信号易淬灭、不可再生，不便于对活细胞的分裂、运动等的观察、研究等缺点；同时，有机染料能快速进入活细胞中与DNA结合，因此对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物，使用过程中需要注意操作与抛弃的处理程序，以避免对实验人员的伤害和对环境的污染。

随着生物医学研究的开展，对于细胞、细胞核标记的要求越来越高，现有的有机荧光染料不能达到永久细胞核标记的要求。

因此开发一种永久标记细胞核的慢病毒表达载体及永久标记细胞核的方法，其可以同时标记细胞核及细胞，可以安全、永久、准确地观察细胞在体内体外的存活、有丝分裂、运动的情况。本发明提供的载体及方法对细胞的生长无影响，具有良好的应用前景和发展空间。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于标记细胞核的慢病毒表达载体，其可用于永久标记细胞核，且对细胞生长无影响。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种用于标记细胞核的慢病毒表达载体，其表达区包含核定位荧光标记、荧光标记序列，所述核定位荧光标记中核定位信号序列连接于荧光蛋白序列上游；其中荧光标记与核定位荧光标记编码的蛋白呈现不同颜色的荧光信号。

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，形成稳定遗传物质，使得目的基因在细胞中可稳定长期表达。根据本发明的慢病毒表达载体，当包装后用于感染细胞，核定位荧光标记及普通荧光标记均能够在细胞中永久表达。

核定位信号(Nuclear localization signal，NLS)是蛋白质的一个结构域，通常为一短的氨基酸序列，它能与入核载体相互作用，使蛋白能被运进细胞核，且完成核输入后不被切除。本发明的核定位荧光标记具有核定位信号序列，所以编码的荧光蛋白定位于细胞核。而普通荧光标记序列编码的蛋白位于整个细胞。

前面提到：荧光标记与核定位荧光标记编码的蛋白呈现不同颜色的荧光信号。因此，整个细胞呈现出一种荧光，而细胞核呈现出另一颜色的荧光信号。也就是说，本发明的慢病毒表达载体可以同时永久标记细胞核及细胞。

NLS由4-8个氨基酸组成，含有Pro、Lys和Arg。

作为优选的方案，上述核定位信号序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

进一步，上述核定位信号序列的的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

目前，被发现的荧光蛋白颜色越来越多。核定位荧光信号中荧光蛋白和荧光蛋白分别选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、深红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或青色荧光蛋白等中的一种。