[发明专利]一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒

权利要求书

1.一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，其特征在于，能够同时快速检测 14 种水藻及2种气单胞菌共 14 个基因，14 种水藻包括普通小球藻、桥弯藻、蛋白核小球藻、舟形藻、异极藻、小环藻、产毒铜绿微囊藻、脆杆藻、念珠藻、针杆藻、血红哈卡甲藻、伊姆裸甲藻、锥状斯克里普甲藻和链状亚历山大甲藻，2种气单胞菌包括杀鲑气单胞菌和维氏气单胞菌，包括用于扩增检测14种藻类的11 个基因位点的引物：硅藻叶绿体rbcl-1（ND-1）、塔玛亚历山大藻COⅠ（JIA COX）、蓝藻核糖体16S（359）、硅藻叶绿体rbcl-2（ND-2）、鱼腥藻属mcyD（mcyD）、菱形藻属核糖体18S（Dia）、筒孢藻属念珠藻科CENA33(CBR)、片状微囊藻16S (WN)、硅藻核糖体23S(UPA-99)、中肋骨条藻线粒体细胞COXⅠ(Cox120)、塔玛亚历山大藻叶绿体psbA(Psba)；以及扩增检测2种气单胞菌的3个基因位点的引物：嗜水气单胞菌AER(JUNAER)、维氏气单胞菌聚合酶σ-70因子基因proD（proD-WS）、维氏气单胞菌Hly(HLYA)，其中括号内的内容表示引物对应的基因座；

所述 14 对引物核苷酸序列为：硅藻叶绿体rbcl-1基因的引物如SEQ ID NO.1~2所示，塔玛亚历山大藻COⅠ基因的引物如SEQ ID NO.3~4所示，嗜水气单胞菌AER基因的引物如SEQID NO.5~6所示，蓝藻核糖体16S基因的引物如SEQ ID NO.7~8所示，硅藻叶绿体rbcl-2基因的引物如SEQ ID NO.9~10所示，鱼腥藻属mcyD基因的引物如SEQ IDNO.11~12所示，菱形藻属核糖体18S基因的引物如SEQ ID NO.13~14所示，筒孢藻属念珠藻科CENA33基因的引物如SEQ ID NO.15~16所示，片状微囊藻16S基因的引物如SEQ ID NO.17~18所示，硅藻核糖体23S基因的引物如SEQ ID NO.19~20所示，中肋骨条藻线粒体细胞COXⅠ基因的引物如SEQ IDNO.21~22所示，维氏气单胞菌聚合酶σ-70因子基因proD基因的引物如SEQ ID NO.23~24所示，塔玛亚历山大藻叶绿体psbA基因的引物如SEQ ID NO.25~26所示，维氏气单胞菌Hly基因的引物如SEQ ID NO.27~28所示。

2.根据权利要求 1 所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，其特征在于，所述引物在扩增体系中的终浓度为：SEQ ID NO.1~2：0.2µM；SEQ ID NO.3~4 ：0.5µM； SEQ IDNO.5~6：2. 5µM；SEQ ID NO.7~8：0.2µM；SEQ ID NO.9~10：0. 5µM；SEQ ID NO.11~12：1.5µM；SEQ ID NO.13~14：0.2µM；SEQ ID NO.15~16：0.2µM；SEQ ID NO.17~18：0.1µM；SEQ IDNO.19~20：0.1µM；SEQ ID NO.21~22：1.5µM；SEQ ID NO.23~24 ：0.6µM；SEQ ID NO.25~26：1.2µM；SEQ ID NO.27~28：1.2µM。

3.根据权利要求 1 所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，其特征在于，所述 14 个基因位点的引物分组进行荧光染料标记，第一组：硅藻叶绿体rbcl-1、塔玛亚历山大藻COⅠ、嗜水气单胞菌AER、蓝藻核糖体16S、硅藻叶绿体rbcl-2；第二组：鱼腥藻属mcyD、菱形藻属核糖体18S、筒孢藻属念珠藻科CENA33、片状微囊藻16S；第三组：硅藻核糖体23S、中肋骨条藻线粒体细胞COXⅠ；第四组：维氏气单胞菌聚合酶σ-70因子基因proD、塔玛亚历山大藻叶绿体psbA、维氏气单胞菌Hly。

4.根据权利要求 3 所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，其特征在于，每组引物采用蓝色荧光染料 6-FAM、绿色荧光染料 HEX、黄色荧光染料 TAMRA 、红色荧光染料 ROX 中任一种进行标记，且各组之间的标记色均不相同；内标选用橙色荧光标记，标记物为 SIZ。

5.根据权利要求 3 所述的一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，其特征在于，所述每对引物中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记。