[发明专利]一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒

说明书

本发明公开了一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒，其特征在于，所述检测体系包括用于扩增检测14种藻类的11个基因位点的引物以及扩增检测2种气单胞菌的3个基因位点的引物。本发明具有特异性好，灵敏度高的优点，可以较快速的鉴定样本中藻类，并且由于复扩系统中包含检测气单胞菌的引物，可以同时鉴定样本中是否存在气单胞菌；并有助于对水中尸体进行溺死诊断，而且可以根据鉴定出的藻类样本推测溺死地点。

技术领域

本发明属于微生物分子生物学领域，具体涉及一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒。

背景技术

水中发现的尸体死亡原因可能有多种，如属于意外溺水死亡,也可能是自杀、他杀、死后抛尸入水伪造意外溺水死亡的刑事案件。因此，确定水中尸体是否是溺死是解决上述问题的关键。目前，国内外对判断水中尸体是否为溺死的方法一般根据尸表检查、尸体解剖以及相关实验室检查、藻类检验等综合分析结果的基础上做出的判定。

有报道称使用针对在水域中存在且分布广泛甲藻、绿藻、蓝藻、硅藻等藻类基因的特异性引物来进行溺死诊断的研究，同时也有研究使用针对不同藻类基因的特异性引物来检测溺死尸体脏器中的藻类来诊断溺死。本发明同时应用毛细管电泳检测溺死相关藻类多个位点基因，由于毛细管电泳法应用广泛、操作简单,在溺死鉴定中易普及推广，希望为溺死诊断提供一种新方法。

一些案例中尸体己经有不同程度的腐败或是已经白骨化时，溺死的尸体征象已经不复存在，此时藻类检验是溺死诊断不可或缺的手段，可以为判定溺死提供有力信息。近年来利用分子生物学技术来检验浮游生物研究溺死成为热点，己经研究证实溺死尸体脏器中存在的几种溺死相关藻类，如蓝藻、绿藻、甲藻、硅藻等藻类，这些藻类可同时随溺液进入溺死者体液循环中。

一对引物的PCR扩増体系与多重PCR技术相比，由于水中尸体腐败导致检测的鞭基因降解而使模板量减少可能导致PCR扩増失败引起假阴性结果，而多重PCR技术增加了检测对象的种类或(和)靶基因的数量，可能对于提高溺死诊断的可靠性是一种有效的方法。

PCR扩増后的产物除实时定量PCR技术扩増后无需对产物进行电泳检测，其它PCR技术扩増产物均需电泳检测，常用有琼脂糖-EB电泳、PAGE电泳等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系及试剂盒，采用荧光引物复扩和毛细管电泳方法结合，能够同时快速检测14种水藻及2种嗜水气单胞菌共14个基因，具有特异性好，灵敏度好的优点，可以较快速的鉴定样本中藻类，并且由于复扩系统中包含检测气单胞菌的引物，可以同时鉴定样本中是否存在气单胞菌；并有助于对水中尸体进行溺死诊断，而且可以根据鉴定出的藻类样本推测溺死地点。

本发明采用的技术方案是：

一种溺死相关浮游生物复合扩增检测体系，所述体系中包括用于扩增检测14种藻类的11个基因位点的引物：硅藻叶绿体rbcl-1（ND-1）、塔玛亚历山大藻COⅠ（JIA COX）、蓝藻核糖体16S（359）、硅藻叶绿体rbcl-2（ND-2）、鱼腥藻属mcyD（mcyD）、菱形藻属核糖体18S（Dia）、筒孢藻属念珠藻科CENA33(CBR)、片状微囊藻16S (WN)、硅藻核糖体23S(UPA-99)、中肋骨条藻线粒体细胞COXⅠ(Cox120)、塔玛亚历山大藻叶绿体psbA(Psba)；以及扩增检测2种气单胞菌的3个基因位点的引物：嗜水气单胞菌AER(JUN AER)、维氏气单胞菌聚合酶σ-70因子基因proD（proD-WS）、维氏气单胞菌Hly(HLYA)，其中括号内的内容表示引物对应的基因座。

所述的引物对中的引物碱基序列及浓度如表1所示：