[发明专利]从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法及其用途，该方法先通过提取、萃取、大孔吸附树脂层析、酸解处理茶花粉，再采用高速逆流色谱（HSCCC）进一步分离，最后通过高效液相色谱、核磁共振和质谱分析确定所得化合物为对羟基肉桂酸乙酯，从而实现了从茶花粉中直接分离纯化出对羟基肉桂酸乙酯；在从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯时，具有无不可逆吸附、无样品污染和变性、回收率高、分离量大、分离效率高、操作简单和重现性好等优点。该对羟基肉桂酸乙酯可用于制备酪氨酸酶抑制剂。

技术领域

本发明涉及分离提纯技术领域，具体涉及一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法及其应用。

背景技术

茶花粉是雄性生殖细胞，是遗传基因源，担负着植物遗传的任务，具有全面的营养及多种生物学功能。其活性成分如多酚、黄酮、多糖以及脂质类物质等对茶花粉的抗氧化、抑菌、降血糖、降血脂、抗肿瘤、调节机体免疫能力等生物活性具有极其重要的作用。

对羟基肉桂酸乙酯是对羟基肉桂酸的衍生物，具有抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性。目前，对羟基肉桂酸乙酯主要是通过硅胶柱、凝胶柱及制备型高效液相色谱法等手段从天然产物中分离纯化出。但是，上述的分离纯化方法存在分离时间长、易形成死吸附、会降低产物活性等缺点，因此在对羟基肉桂酸乙酯的分离纯化方面，新的替代方法越来越受关注。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一，即提高分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的效率、无不可逆吸附、无样品污染和变形、回收率高。为此，本发明的一个目的在于提出一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法。

本发明的另一个目的在于提出对羟基肉桂酸乙酯作为酪氨酸酶抑制剂的用途。

为达到上述目的，本发明第一方面实施例提出了一种从茶花粉中分离纯化对羟基肉桂酸乙酯的方法，其包括以下步骤：

S1、提取：取粉碎的茶花粉，按料液比1g:5mL-25mL加入0%-95%的乙醇，于30℃-70℃下水浴浸提6h，共提取3次，抽滤，合并滤液，并于50℃下减压浓缩成浸膏，得粗提物；

S2、萃取：粗提物按料液比1g:10mL加入蒸馏水，搅拌溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，均萃取3次，而后将它们分别置于50℃旋转蒸发仪中减压浓缩，得石油醚相、乙酸乙酯相及正丁醇相；

S3、大孔吸附树脂层析：取乙酸乙酯相，按料液比1g:10mL加入蒸馏水复溶，振荡，4500 r/min离心12min，取上清液加入大孔树脂中，大孔树脂置于37℃下150r/min的摇床中吸附16 h，将吸附后的大孔树脂装柱，使用不同浓度的乙醇水溶液进行洗脱，洗脱体积均为5个柱体积，收集各洗脱组分，得大孔树脂30%乙醇洗脱相；

S4、酸解：取大孔树脂30%乙醇洗脱相 ,按料液比0.1g:50mL加入无水乙醇,而后再加入等体积4M的盐酸,于90℃水浴中酸水解90 min,将酸解液置于50℃旋转蒸发仪上减压蒸干，获得大孔树脂30%乙醇洗脱相酸解物；

S5、HSCCC制备分离：配置正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶液体系，体积比为4:6:4:6，充分震荡，静置分层，分别收集上相和下相溶液，超声脱气，上相为固定相，下相为流动相，采用头-尾洗脱，将固定相以30 mL/min的流速泵满色谱柱，稳定后，调节转速至700rpm-900rpm，将流动相以3mL/min-6 mL/min的流速泵入色谱柱中；两相达平衡后由进样阀进入样品溶液，样品溶液为30%乙醇洗脱相酸解物,同时通过紫外检测器检测流出物，紫外检测波长设置为280nm，根据峰行收集各组分；

S6、组分鉴定：将步骤S5收集到的组分按顺序编号，以对羟基肉桂酸乙酯标准品作为对照，利用高效液相色谱、核磁共振、质谱的方法进行鉴定，即可确定某一编号对应的组分为对羟基肉桂酸乙酯。