[发明专利]一种新金色分枝杆菌突变株及其在制备HIP的应用

说明书

本发明提供一种能够将植物甾醇转化为HIP的新金色分枝杆菌突变株MN PJ‑5及其应用，该菌株的保藏编号为CGMCC No.15575。该菌株以植物甾醇为底物，转化HIP的产率为0.47‑0.52g/g植物甾醇(折纯)，HIP的产率是已公开菌株HIP产率的1.82倍。以植物甾醇为底物，发酵液中HIP比例占产物的90.74‑99.10％，同时副产物的产率大大低于已公开菌株，可用于HIP的生产。本发明还提供了基于该新金色分枝杆菌制备HIP的方法。本发明提供的新金色分枝杆菌与已有方法相比，HIP得率高，副产物少，并且对环境没有污染。此外，本发明的菌株MN PJ‑5具有高产性状稳定的特点，该菌株经过6个月的传代，性能保持稳定。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种新金色分枝杆菌的新菌株及其在制备甾体化合物中间体HIP中的用途。

背景技术

甾体激素类药物是我国医药领域的重要门类，在临床上被广泛使用。最初人们主要是从动物肾上腺、性腺和尿液中提取甾体药物，如雌酮、雌二醇、睾丸酮等天然甾体激素晶体，由于这些原料来源少、含量低、合成路线长、成本高等，并不能满足实际生产的需要。随后科研人员开始从植物中寻求起始原料，20世纪30年代中期，日本科学家分离出了薯蓣皂素，为甾体药物工业提供了资源丰富又廉价易得的天然原料，在相当长的一段时间内，人们利用薯蓣皂素原料为原料，通过化学合成法生产甾体药物。但是，因甾体化合物结构复杂，合成步骤多、生产工艺复杂，污染大，收率低，导致成本很高，经济效益薄弱。后来人们发现一些微生物，如诺卡氏菌、假单胞菌、分枝杆菌、节杆菌等能以甾醇为唯一碳源生长，随后又发现细菌、放线菌、酵母、霉菌中的某些菌株可以使甾体化合物的特定部位发生转化，其反应专一性表现出了巨大优势。在微生物降解甾醇的代谢过程中很多代谢中间体可用于生产甾体药物的原料，具有明显的优势，如AD、9-OH AD、ADD等。但甾体并不是微生物代谢途径中起生理作用的物质，而是作为能够被菌体利用的碳源和能源物质，最终被分解为CO₂和H₂O。因此，利用微生物降解甾醇生产有用的甾体中间体，必须首先改变微生物的甾体代谢途径。有大量文献报道，利用诺卡氏菌、分枝杆菌、假单胞菌、红球菌、节杆菌属等微生物的突变株能够降解甾醇类物质来生产甾体药物及其中间体，其中以分支杆菌属和红球菌属的应用最为广泛。微生物降解甾醇生产甾体药物中间体已逐渐成为现代医药工业生产甾体激素类药物的主流，占据着极其重要的地位。

甾体类物质在上述菌中的降解为有氧降解，以分支杆菌降解胆固醇为例，其降解过程(见图3)为：一、胆固醇(I，cholesterol)转化为胆甾-4-烯-3-酮(cholest-4-en-3-one)；二、侧链降解：与第一步的氧化同时进行，过程类似于脂肪酸的β-氧化，在一系列酶的催化下，生成一种重要的甾体激素前体物质雄甾-4-烯-3,17-二酮(II，androst-4-ene-3,17-dione，简称AD)；三、中心环的降解：在一系列酶作用下，AD分裂为2-羟-2,4-二烯己酸(III，2-hydroxyhexa-2,4-dienoic acid)和9,17-二氧代-1,2,3,4,10,19-六降雄甾烷-5-羧酸(IV，9,17-dioxo-1,2,3,4,10,19-hexanorandrostan-5-oic acid，简称HIP)；四、下游降解途径：2-羟-2,4-二烯己酸经过一系列酶逐步分解，能量进入三羧酸循环，而HIP被转化为3aα-H-4α-(3’-丙酸)-5α-羟基-7aβ-甲基六氢-1-印酮-δ-内酯(V，3aα-H-4α-(3’-propionic acid)-5α-hydroxy-7aβ-methylhexahydro-1-indanone-δ-lactone，简称HIL)，进一步被完全降解为CO₂和H₂O。其中，HIP可用于合成雌酚酮、雌二醇及其衍生物等重要药物或中间体。