[发明专利]一种低丰度突变DNA的Loop式富集检测引物及其应用

权利要求书

1.一种低丰度突变DNA的Loop式富集检测引物，其特征在于，包括上游引物，所述上游引物由辅助引物、连接序列和扩增引物组成，所述辅助引物、连接序列和扩增引物依次连接；

所述辅助引物长度为11-16nt，其上设计有所述突变DNA的突变位点，所述辅助引物与所述突变DNA可完全互补配对，并与所述突变DNA相对应的野生DNA有一个突变碱基的不匹配；

所述扩增引物长度为10-14nt，与所述突变DNA和野生DNA均可完全匹配；

所述辅助引物Tm值高于扩增引物Tm值3℃以上；

所述富集检测引物与所述突变DNA结合时，所述扩增引物结合区域位于所述辅助引物结合区域的上游，且所述辅助引物的5’末端与所述扩增引物的3’末端在所述突变DNA上的结合位置间隔0-5个碱基；

所述连接序列与所述突变DNA和野生DNA均不结合。

2.根据权利要求1所述富集检测引物，其特征在于，所述连接序列由Oligo(dT)和C12Spacer组成。

3.根据权利要求2所述富集检测引物，其特征在于，所述Oligo(dT)聚合度为25-35nt。

4.根据权利要求1所述富集检测引物，其特征在于，所述辅助引物长度为11-16nt，其上设计有突变EGFR的突变位点，所述辅助引物与突变的EGFR可完全互补配对，并与野生EGFR有一个突变碱基的不匹配；

所述扩增引物长度为10-14nt，与所述突变的EGFR和野生的EGFR均可完全匹配。

5.根据权利要求4所述富集检测引物，其特征在于，所述辅助引物长度为11-16nt，其上设计有突变EGFR的T790M突变位点，所述辅助引物与突变EGFR可完全互补配对，并与野生EGFR有一个突变碱基的不匹配；

所述扩增引物长度为10-14nt，与所述突变EGFR和野生EGFR均可完全匹配。

6.根据权利要求5所述富集检测引物，其特征在于，所述辅助引物的序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求5所述富集检测引物，其特征在于，所述扩增引物的序列如SEQ ID NO:2所示。

8.根据权利要求4所述富集检测引物，其特征在于，所述辅助引物长度为11-16nt，其上设计有突变EGFR的L858R突变位点，所述辅助引物与突变EGFR可完全互补配对，并与野生EGFR有一个突变碱基的不匹配；

所述扩增引物长度为10-14nt，与所述突变EGFR和野生EGFR均可完全匹配。

9.根据权利要求8所述富集检测引物，其特征在于，所述辅助引物的序列如SEQ ID NO:3所示。

10.根据权利要求8所述富集检测引物，其特征在于，所述扩增引物的序列如SEQ IDNO:4所示。

11.根据权利要求1-10任意一项所述富集检测引物，其特征在于，还包括下游引物。

12.根据权利要求11所述富集检测引物，其特征在于，当辅助引物上设计有突变EGFR的T790M突变位点时，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:5所示。

13.根据权利要求11所述富集检测引物，其特征在于，当辅助引物上设计有突变EGFR的L858R突变位点时，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示。

14.权利要求1-13任意一项所述富集检测引物在检测突变DNA和/或制备检测突变DNA试剂盒中的应用。

15.一种检测低丰度突变DNA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-13任意一项所述富集检测引物。