[发明专利]一种低丰度突变DNA的Loop式富集检测引物及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种低丰度突变DNA的Loop式富集检测引物及其应用。本发明通过一段Loop式结构连接两段短的核苷酸序列，利用碱基堆积作用达到突变型和野生型的差异扩增，可将浓度低至万分之一的突变富集至百分之一～十分之一，达到Sanger测序的检测范围，使其可与Sanger测序相结合进行低丰度突变的检测。本发明适用于突变含量低的外周血游离DNA的检测，具有采样简单、方便，对病患造成的痛苦少，该检测技术具有特异性好、灵敏度度高、操作简单，检测周期短，检测成本低等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种低丰度突变DNA的Loop式富集检测引物及其应用。

背景技术

检测生物样本中DNA突变或微量等位基因在肿瘤诊断、筛查和预后检测等领域具有重要意义。目前基于PCR检测DNA突变的技术主要有ARMS-PCR技术(amplificationrefractory mutation system PCR)、基于酶切的PCR富集技术、基于连接的PCR富集技术、基于Blocker阻碍的PCR富集技术、低变性温度的复合PCR富集技术(co-amplification atlower denaturation temperature PCR，COLD-PCR)以及Digital PCR技术等。

由于有些晚期癌症患者，比如晚期肺癌患者的组织样本难以获取，对其检测造成一定的局限性，因此需要找到更易于获取的标本进行检测，如外周血循环DNA的检测。基于外周血循环DNA与相应的原发性肿瘤细胞在遗传特异性上相一致，可以将其作为肿瘤诊断、筛查和预后检测等的检测指标，因此，外周血游离DNA的检测成为目前研究的热点。

然而，外周血循环DNA中突变核酸含量较低，以肺癌表皮生长因子受体(EGFR)突变检测为例，Sanger测序和ARMS-PCR法这两种方法的灵敏度均较低，测序仅能检测出5％以上的EGFR单碱基位点突变，ARMS-PCR法可检测十分之一～千分之一的EGFR单碱基位点突变，采用Sanger测序和ARMS-PCR法均难以检测出突变。这就需要一种检测灵敏度高的检测技术，目前常用的是Digital PCR，该技术可检测千分之一～十万分之一的突变，但该技术依赖特定仪器进行检测，检测成本高昂。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种低丰度突变DNA的Loop式富集检测引物，特别是用于检测EGFR突变中的L858R和T790M突变的富集检测引物，使得所述引物灵敏度高、特异性好，并且可有效的富集并检测出样本中低至万分之一的突变，可将万分之一的突变模板富集100～1000倍以上；

本发明的另外一个目的在于提供包括所述富集检测引物的检测试剂盒，适用于普通PCR和实时荧光定量PCR，特别是应用在EGFR突变中的L858R和T790M突变检测中；

本发明的另外一个目的在于提供使用所述富集检测引物检测低丰度DNA的方法，适用于普通PCR和实时荧光定量PCR，特别是应用在EGFR突变中的L858R和T790M突变检测中。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种低丰度突变DNA的Loop式富集检测引物，包括上游引物，所述上游引物由辅助引物、连接序列和扩增引物组成，所述辅助引物、连接序列和扩增引物依次连接；

所述辅助引物长度为11-16nt，其上设计有所述突变DNA的突变位点，所述辅助引物与所述突变DNA可完全互补配对，并与所述突变DNA相对应的野生DNA有一个突变碱基的不匹配；

所述扩增引物长度为10-14nt，与所述突变DNA和野生DNA均可完全匹配；

所述辅助引物Tm值高于扩增引物Tm值3℃以上；优选为高于3-10℃，更优选为高于3-5℃；在具体实施方式中，可选择为高于3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃。