[发明专利]一种检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了一种检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒及其方法，包含序列表中序列1‑4所示CYP3A4*1G的特异性上下游引物序列、序列5‑8所示CYP3A4*1G的特异性TaqMan‑MGB双荧光探针序列、序列9‑12所示CYP3A5*3的特异性上下游引物序列和序列13‑16所示CYP3A5*3的特异性TaqMan‑MGB双荧光探针序列。本发明的有益效果为特异性强、防污染、灵敏度高、检测速度快、结果分析简单且准确性高、该试剂盒可以通过检测CYP3A4、CYP3A5基因多态性位点，判断待测对象对芬太尼类药物的代谢能力，从而更准确有效地指导芬太尼类等药物的用药，具有实际的临床应用价值。将该试剂盒应用于临床的诊断后，与现有技术的吻合度更高，且价格低廉、可重复性高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基因检测，更具体地涉及CYP3A4、CYP3A5多态性位点基因检测试剂盒及其方法。

背景技术

CYP3A4是CYP3A亚家族中最主要的成员,占P450酶系总量的30％～40％,主要分布在肝脏和肠道。它参与了许多药物和外源性毒物的氧化代谢,可代谢约50％的临床常用药物。研究表明,人肝脏中CYP3A4的表达及其活性存在着明显的个体差异,并且这种差异90％与遗传多态性有关。CYP3A4基因位于人类第7号染色体7q21.1-q22.1上，长约27kbp，其基因结构包括13个外显子及12个内含子。CYP3A4*1G(20230G>A)是CYP3A4内含子10中的一个单核苷酸多态性(SNP)，其在中国汉族人群中的发生频率为22.1％～37％。CYP3A4*1G与阿托伐他汀、环孢霉素、他克莫司、芬太尼等药物的剂量、疗效及药代动力学改变有关。

CYP3A5位于人类7号染色体q21.1-q22.1，基因全长为31.8kb，有13个外显子，编码502个氨基酸。CYP3A5占CYP3A总量的50％，主要在肝和小肠及其他肝外组织如肾、前列腺和肺中表达，CYP3A5表达和活性呈高度多态性，有广泛个体与种族差异。CYP3A5酶的氨基酸与编码CYP3A4酶的氨基酸有84％的相似性，CYP3A5酶和CYP3A4酶具有诸多重叠的代谢底物和相似的催化活性，但CYP3A5酶活性比CYP3A4低80％。其中位于内含子3的SNP(6986A>G突变)最为重要，突变定义为CYP3A5*3，在中国人群中的发生频率较高(71％～77.8％)。

芬太尼类药物为人工合成的强效麻醉性镇痛药，镇痛机制与吗啡相似，为阿片受体激动剂，作用强度为吗啡的60-80倍。其主要通过肝脏细胞色素酶P450系统的CYP3A4/CYP3A5亚家族代谢，药物在体内的代谢速率受酶活影响。芬太尼类药物为临床主要的麻醉用药，但药物剂量一旦过量，会导致呼吸抑制甚至死亡的危险。通过检测芬太尼类药物的主要代谢基因CYP3A4/CYP3A5的基因位点，来判断患者对芬太尼类药物的代谢能力，从而指导药物的使用剂量。

目前很多药物通过P450家族的酶代谢，测定P450基因型，确定酶活很关键。但是CYP3A4、CYP3A5基因的几个关键位点，由于序列结构比较特殊，设计荧光探针的难度较大，且设计出来的探针对基因型的分别率不高，同时与之匹配的PCR引物要求也高，引物本身或上下游引物之间存在二级结构，或引物与DNA模板的结合效率低，上下游引物之间的DNA模板序列存在高GC等特殊结构，都将导致PCR效率低。目前市场上销售的分型产品，只有全球最大的生物公司Thermal Fisher提供，其序列与配方全部保密，且试剂盒价格昂贵。目前国内一般采用直接测序法和定性PCR法来检测基因多态性。这两种方法的灵敏度和特异性均不高，并不能准确的检测出基因多态性。此外，直接测序大部分采用外包实验，检测时间太长，至少需要24小时，为检测带来不便。

综上所述，本领域迫切需要开发操作简便、特异性好、准确率高、能高效地检测CYP3A4、CYP3A5多态性位点的试剂盒和方法，以弥补国内CYP3A4、CYP3A5基因检测方面的不足。

发明内容