[发明专利]一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法及其应用

权利要求书

1.一种酿酒酵母无痕基因敲除方法，其特征在于：以保藏编号为CICC32315的酿酒酵母AY15的单倍体α5为出发菌株，BAT2基因为靶基因，实现对基因BAT2的无痕敲除；步骤如下：

以酵母YHWA245基因组为模板，用PCR方法扩增出HERP1.0片段，将该片段克隆至YEp352质粒，构建YHERP1.0质粒；所述HERP1.0 片段为P_GAL1-SCE1-P_TEF1-HSV-TK-T_TEF1；

用PCR方法分别扩增敲除靶基因BAT2上游500bp和下游683bp的同源序列片段，然后通过融合PCR获得无缝融合片段BAT2U-BAT2D；

将该片段克隆至质粒YHERP1.0上，获得重组质粒YHERP1.0-BAT2U-BAT2D；

用PCR方法分别扩增敲除靶基因上游597bp及YHERP1.0-BAT2U-BAT2D的片段；

通过醋酸锂转化法将这两个片段同时导入出发菌株中，经过YPGly+AF筛选培养基进行第一步整合的筛选，获得含抗性基因的突变株；

用半乳糖诱导培养基在30℃，180rpm培养24h，稀释100倍后涂布于含有5-氟-2’-脱氧尿苷的合成培养基平板上，30℃培养36h，获得第二步整合重组的酿酒酵母菌株；

所述YPGly+AF培养基成分为5%甘油、2%蛋白胨、1%酵母浸粉、200mg/mL氨甲基叶酸、5mg/mL磺胺、5μg/mL胸腺嘧啶，50μg/mL次黄嘌呤；

所述半乳糖诱导培养基中半乳糖的含量0.5 g/100mL，蛋白胨2 g/100mL，酵母浸粉1g/100mL；

扩增HERP1.0基因片段上下游引物分别为：SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2；

扩增BAT2基因上游500bp的上下游引物分别为：SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4；

扩增BAT2基因下游683bp的上下游引物分别为：SEQ ID NO 5. 、SEQ ID NO. 6；

扩增靶基因上游597bp的上下游引物分别为：SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8；

扩增YHERP1.0-BAT2U-BAT2D的上下游引物分别为：SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 6。

2.如权利要求1所述的酿酒酵母无痕基因敲除方法在酵母基因改造中的应用。