[发明专利]一种高效的酿酒酵母无痕基因敲除方法及其应用

说明书

本发明公布了一种在酿酒酵母中高效无痕敲除的方法，并通过对该无痕基因敲除系统中的正向同源序列、半乳糖浓度及半乳糖诱导时间进行优化，第二步同源重组的概率达到6.86×10^‑4。以酿酒酵母AY15的单倍体α5为出发菌株，BAT2基因为靶基因，实现对野生酿酒酵母菌株基因BAT2高效的无痕敲除，通过白酒发酵实验，改造菌株的正丙醇、异丁醇和异戊醇含量亲本菌株相比分别降低了20.32％、47.85％和23.14％，达到了低产高级醇的目的。该方法可广泛应用于酵母及其他微生物的基因改造，由于所获得的突变株不残留任何外源基因，可以安全的用于工业生产，为直接在工业菌株中进行基因敲除提供了有益的参考。

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，具体是在酿酒酵母中构建一种高效的无痕基因敲除方法并用该方法构建了一株低产高级醇的酿酒酵母菌株。

背景技术：

酿酒酵母是一种典型的真核细胞模型和重要的模式生物，它的特性包括：生长繁殖快、代谢周期短、易于分离和培养等，这些特性使酿酒酵母更方便于进行基因工程和遗传学研究，称为真核生物中的“大肠杆菌”。随着分子生物学以及基因工程技术的不断发展和不断更新，酿酒酵母的育种方法已经由最初的自然育种发展为现代的定向基因工程育种。基因敲除(gene knockout)是20世纪80年代末发展起来的一种遗传工程技术，是通过适当的方法使机体特定的基因缺失或失活，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。但是随着公众对食品安全的关注，通过传统遗传学方法构建的菌株，由于残留非本身的外源基因，其生产应用受到限制。因此应用无痕敲除技术敲除机体的特定基因成为目前遗传育种的发展方向。

酵母菌的无痕修饰起初是为了除去筛选标记，以便在单个菌株中进行多基因操作。去除筛选标记主要有两种方法，一种是利用重组酶介导的敲除系统，例如Cre/Loxp系统，Cre重组酶能介导两个LoxP位点之间发生特异性重组，把两个位点间的基因删除。通过第一次化学转化，将带有同向两个LoxP位点和筛选标记的片段整合到基因组上；然后通过第二次化学转化导入带有编码Cre重组酶基因的质粒，利用Cre重组酶的表达切除两个位点之间所有序列，从而完成筛选标记的去除。2004年，Iwaki等人将该系统应用于酵母中，实现了对酵母的多基因敲除。Cre/loxP方法具有很高的效率，但是会在染色体上残留一个外源序列(LoxP位点)，当进行多基因敲除时候，残留的LoxP位点增加了染色体重排的可能。另一种方法则是利用敲除元件中正向重复序列(hisG)之间的同源重组，首先需要构建带有“hisG—URA3—hisG”的质粒，然后使用长引物PCR直接得到敲除元件，通过转化敲除目的基因后，再反向筛选，利用正向重复序列(hisG)之间的同源重组去除筛选标记。2012年，Dong等人应用该方法实现了酵母基因的无痕敲除，但是该方法在诱导第二步同源重组的几率是随机的，产生的转化子不只一种，使得最终得到理想转化子的几率变低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas))出现，它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简单、成本低、作用高效。2014年，Bao等首次利用CRISPR-Cas系统对酿酒酵母实现多基因一步敲除。但是该系统中设计的向导RNA(sg RNA)在指导Cas蛋白与基因组进行识别时会与非靶点DNA序列错配，引入非预期的基因突变，即脱靶效应，严重制约了该技术的广泛应用。总之，本领域仍需要一种高效的无痕基因敲除方法。