[发明专利]一种鉴别铁皮石斛和霍山石斛的ISSR引物及其方法

说明书

本发明公开了一种鉴别铁皮石斛和霍山石斛的ISSR引物及其反应体系，所述的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示，利用该引物及优化后的反应体系对铁皮石斛和霍山石斛DNA进行扩增即可完成。本发明引物及方法简单、节约时间和成本，对鉴别铁皮石斛和霍山石斛、分析其遗传关系等具有较好的应用价值。

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种鉴别铁皮石斛和霍山石斛的ISSR引物及其反应体系。

背景技术

石斛类药材作为名贵中药，药用历史悠久、来源广泛,掺伪现象极为突出。其中霍山石斛和铁皮石斛因形态结构的相似性，常相互混伪。铁皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)为兰科石斛属最为珍稀名贵的种，药用部位为新鲜或干燥茎，具有益胃生津、滋阴清热、润肺止咳、明目强身等功效。霍山石斛(Dendrobium huoshanenseC.Z.TangetS.J.Cheng)，又名霍石斛、霍斛、米斛、大别山石斛，是兰科植物种类最多和分布最广的属之一。铁皮石斛的生长周期缓慢，生长条件苛刻，市场需求大，因而出现了伪品。而霍山石斛名贵稀有，导致经常出现以铁皮石斛冒充的现象。因此，构建高效快捷的鉴别体系对于铁皮石斛和霍山石斛的鉴定及资源保护具有重要意义。

分子标记技术能从DNA水平上反映物种的遗传差异，是研究遗传多样性的有效方法。ISSR是一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记，因其简便迅速、多态性高、重复性好等优点被广泛应用于动植物的品种鉴定等。但ISSR标记是一种随机性标记方法，不同物种甚至同一物种不同条件下其试验参数均有差异，因此建立一个科学合理的ISSR-PCR反应体系，探寻最佳的PCR各组分的用量，可以为进一步利用ISSR标记鉴别铁皮石斛和霍山石斛提供理论依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种优化后的鉴别铁皮石斛和霍山石斛的ISSR-PCR分子标记体系。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种鉴别铁皮石斛和霍山石斛的ISSR引物，所述的ISSR引物包括UBC817、UBC826、UBC827、UBC834、UBC842或UBC849六条特异性引物，具体为：

UBC817：CACACACACACACACAA；

UBC826：ACACACACACACACACC；

UBC827：ACACACACACACACACG；

UBC834：AGAGAGAGAGAGAGAGYT；

UBC842：GAGAGAGAGAGAGAGAYG；

UBC849：GTGTGTGTGTGTGTGTYA。

本发明还提供了一种鉴别铁皮石斛和霍山石斛的反应体系，具体包括以下步骤：

1)采集铁皮石斛和霍山石斛的嫩叶，用于提取植物组DNA；

2)采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；

3)采用ISSR-PCR反应体系对步骤(1)所提取的DNA样品进行扩增。

所述的ISSR-PCR反应所用的引物为UBC817、UBC826、UBC827、UBC834、UBC842或UBC849。

所述的ISSR-PCR的扩增体系为：20μL的反应体系中含有2×TaqMaster Mix 11.5μL，模板DNA 35ng，引物0.4μM。

所述的ISSR-PCR的扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52.2～56.2℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃再延伸10min，4℃保存。